203674. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyengített pulyka rhinotracheitis vírus és azt tartalmazó vakcina előállítására
1 HU 203 674 B 2 Orrgennyesed és (napok száma a fertőzés után) TRT semlegesítő antitest titer, 21 nappal később (reciprok) Klinikai légúti betegség a szülőtörzzsel végzett fertőzés után Származék törzs (EP25) 0/8 0/8 0/8 0/8 17; 17; 38; 43; 56; 56; 56; 74; átlag-45 * Az orrgennyesedést mutató pulykák, száma/a csoport tagjainak száma 2. példa A pulyka rhinotracheitis vírus szülőtörzs jellemzése, amely szülötörzs McDougall és Cook közleményéből ismeretes (The Veterinary Record, 1986; 118. 206-207 oldal) A vírus pleomorf. A legtöbb részecske gömbalakú, 80-120 nm átmérővel. Nagyobb részecskék is láthatók azonban, és találhatók megnyújtott és bizarr formák is. A vírusrészecskék sűrűn elhelyezkedő, mintegy 12 nm hosszúságú, a végek felé szélesedő felületi kiugrásokkal rendelkeznek. Ezt az 1. ábrán, (a), (b), (c) és (d) elektronmikroszkópos képeken mutatjuk be. A vírus a csirke, pulyka, liba, egér, tengerimalac vagy nyúl eritrocitákat 4 °C hőmérsékleten, szobahőmérsékleten vagy 37 °C hőmérsékleten nem agglutinálja. A vírus érzékeny kloroformmal végzett kezelésre. Ez a vírus 56 °C hőmérsékleten melegítve 20 percen belül inaktiválódik. A vírus széles pH-tartományban stabU, de 30 percen belül inaktiválódik pH 2,1 -nél. A vírus RNS vírus, amely 1,18-1,19 g/ml koncentrációjú szacharóz sűrűségével egyenértékű sűrűséggel rendelkezik. A vírus legalább hét vírusfajlagos polipeptidet tartalmaz 97*, 82*, 53*. 43,40,35 és 15* kilodalton molekulatömeggel - azok, amelyek csillaggal vannak jelölve, glikozüezet'tek. 3. példa A legyengített törzs kapcsolata a szülötörzzsel A legyengített törzset a szülőtörzs ellen képződött antiszérum semlegesíti. A pulykákban a legyengített törzs ellen termelt antiszérum semlegesíti a szülővírust. A szülő- és származékvírusok hasonló fehérjeprofillal bírnak. A 2. ábra a legyengített törzs elektronmikroszkópos képét mutatja. Amint látható, a vírus mind gömbalakú, mind hosszúkás lehet, felületi kiugrásokkal. 4 4. példa Vírusvizsgálat A 3B pulyka rhinotracheitis 880 mg/1 nátrium-hidrogén-karbonátot tartalmazó, de szérumot nem tartalmazó Eagle-féle minimál esszenciális tápközegen (Eagle’s Minimal Essential Medium, MEM) vizsgáljuk. A tápközeg pH-ja 6,8, és a vizsgálatot 37 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. Lezárt csöveket alkalmazunk. A vizsgálat ciliostatist mutat ki c^irkeembrió légcső szövettenyészeten. CUiostatis akkor következik be, amikor a légcső csilióval borított epiteliális rétegén lévő csillék abbahagyják a mozgást. 5. példa A TRT vírus tojáson/szövettenyészeten passzált törzse legyengülésének kimutatása A TRT vírus legyengített törzsét és két virulens törzset szemcseppek formájában 7 napos TRT-mentes pulykacsibék 15 tagú csoportjainak adagolunk, amelyeket a fertőzés klinikai jeleire nézve naponta megfigyelünk; a betegség súlyosságát pontrendszer alapján - 2. táblázat - értékeljük ki, az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza. Orrkenetből 4 nappal az inokulálás után vírus-visszaizolálást végzünk, és az inokulálás után 5 nappal csoportonként 5 pulykacsibét levágunk, és légcsövüket csilló-áktivitásra nézve vizsgáljuk. Ezt úgy végezzük, hogy 10 vékony szeletet készítünk az egyes légcsövekből és ezeket mikroszkóposán megvizsgáljuk csilló-aktivitásra (4. táblázat). Az aktivitást 0-tól (100% csilló-aktivitás) 4-ig (az aktivitás teljes megszűnése) pontozzuk. Az inokulálás után 21 nappal az összes pulykacsibéből vért veszünk és szérumukat TRT antitestekre ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbánt Assay; enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálat) vizsgálattal vizsgáljuk (5. táblázat). Ezeket a pulykacsibéket egy előzőleg nem inokulált csoporttal együtt, szemcseppek formájában adagolt virulens vírus törzzsel fertőzzük, és a fertőzés klinikai jeleire nézve naponta megfigyeljük. Vírus-visszaizolálást a fertőzést követő negyedik és hatodik napon végzünk, és az összes pulykacsibéből vért veszünk, és levágjuk 14 nappal a fertőzés után. Eredmények A legyengített törzs sokkal enyhébb klinikai tüneteket okoz, mint bármelyik virulens törzs (lásd a 3. táblázatot), és az okozott légcső-károsodás mértéke sokkal enyhébb, mint bármelyik virulens törzs esetén (lásd a 4. táblázatot). TRT vírust izolálunk 4 nappal az inokulálás után minden inokulált csoport pulykacsibéiből vett orrkenetből. Azok a pulykacsibék, amelyek a legyengített törzset kapták, alacsonyabb szerológiai választ adnak ELISA-val mérve, mint azok a pulykacsibék, amelyek virulens törzset kaptak (lásd az 5. táblázatot), de mégis rezisztensek a virulens vírussal végzett fertőzésre (lásd a 3. táblázatot). A fertőzést követően a vírust a kontroll csoportból vett orrkenetből ki lehet nyerni, míg a vakcináit csoportból nem. A kapott eredmények azt igazolják, hogy a törzs le van gyengülve, de mégis képes a pulykacsibék védelmére virulens vírussal történő fertőzés ellen. A váltakozó tojás/szövettenyészet passzálással legyengített törzset úgy választjuk ki, hogy megfelelő legyen lehetséges vakcinatörzsként való felhasználáshoz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
