203674. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyengített pulyka rhinotracheitis vírus és azt tartalmazó vakcina előállítására
1 Hü 203674 B 2 rővel; megnyújtott és bizarr formákat is találunk; c) a részecskéknek sűrűn elhelyezkedő, mintegy 12-14 nm hosszúságú, a végek irányában szélesedő fdűleti kiugrásaik vannak; d) csirke, pulyka, liba, egér, tengerimalac vagy nyúl eritrocitákat 4 °C hőmérsékleten, szobahőmérsékleten vagy 37 °C hőmérsékleten nem agglutinál; e) kloroformmal végzett kezelésre érzékeny; f) 56 °C hőmérsékleten végzett melegítés hatására 20 percen belül inaktiválódik; g) széles pH-tartományon belül stabil, de pH 2,1- nél 30 percen belül inaktiválódik; h) ribonukleinsav (RNS) vírus, sűrűsége mintegy 1,18-1,19 gűnl koncentrációjú szacharóz-sűrűségével egyenértékű; (A meghatározást úgy végezzük, hogy centrifugacsőben szacharóz koncentráció-gradienst alakítunk ki, ennek a tetejére helyezzük a vírust, és nagy sebességgel centrifugáljuk. A vírus a szacharóz-gradiensben addig mozdul el, amíg el nem éri a saját sűrűségének megfelelő szacharóz-koncentrációt. A vírus a szacharóz-gradiens ezen pontján marad attól függetlenül, hogy a centrifugálást milyen hosszú ideig folytatjuk.) i) legalább 7 vírus-specifikus polipeptidet tartalmaz mintegy 97*; 82*; 43; 40; és 15* kilodalton molekulatömeggel; azok, amelyek csillaggal vannak jelölve, glikozilezettek. A gyengített törzs a következő jellemzőkkel bír: a) a szülőtörzs ellen kialakult anti-szérummal semlegesítődüq b) a pulykákban a gyengített törzsre kialakult antiszérum semlegesíti a szülőtörzset; és c) a szülőtörzshöz hasonló fehérje-profilja van. A szülőtörzs ismert törzs, amelyről McDougall és Cook számolnak be fentebb említett cikkükben a Veterinary Recordban. A vírus mRNS és a pulyka rhinotracheitis vírus által indukált polipeptidek elemzése, más, (a)—<i) közti jellemzőkkel együtt azt sugallja, hogy a vírus a Paramyxoviridae család tagja és vannak bizonyos közös jellemzői a légúti syncytialis vírussal, amely a Pneumovírus nemzetség tagja. A fertőző pulyka-rhinotracheitis vírusának gyengített törzse elektronmikroszkópos képét a 2. ábrán mutatjuk be. A találmány szerinti eljárás magában foglalhatja a fertőző pulyka-rhinotracheitis elkészült legyengített törzsének fagyasztva szárítási lépését is, A találmány tárgya továbbá eljárás élő vírustenyészetet tartalmazó vakcina előállítására, amely magában foglalja a fertőző pulyka-rhinotracheitis vírus legyengített törzsének előállítását a találmány említett módszerével. Az élő vírustenyészetet tartalmazó vakcina alkalmas pulyka rhinotracheitis elleni védelemre pulykáknál, továbbá a „duzzadt-fej szindróma” elleni védelemre csirkéknél, alkalmas továbbá pulyka rhinotracheitis vírus vagy szerológiailag rokon törzsek által okozott betegségek elleni védelemre pulykáktól és csirkéktől eltérő szárnyasoknál is. Az élő vírustenyészetet tartalmazó vakcina a fertőző pulyka-rhinotracheitis vírusának legyengített törzséhez folyékony hordozóként tartalmazhat légcső szövettenyészet folyadékot vagy allantoisz üreg folyadékot. Az élő vírustenyészet-vakcinát előállíthatjuk úgy is, hogy a fertőző pulyka-rhinotracheitis vírus legyengített törzsét növesztjük, ismételt inokulálással és kinyeréssel. A növesztést légcső szövettenyésztő folyadékban vagy allantoisz üreg folyadékban végezhetjük. A vakcina előállítása során a fertőző pulyka rhinotracheitis vírus legyengített törzsét bármilyen kívánt módon, például gélszűréssel, szeparálással, gradienscentrifugálással és adszorpcióval és ezt követő eluálással lehet tisztítani. A vakcinát lehet koncentrálni, például zónacentrifugálással, molekuláris szűrést, vagy adszorpciót és ezt követő eluálást alkalmazva. A vakcinát stabilizálószerek hozzáadásával stabilizálni lehet, és megfelelő konzerválószerek, például szarvasmarha-szérum-albumin vagy zselatin hozzáadásával tárolhatóvá lehet tenni. A kész vakcinát sterilitásra, ártalmatlanságra és immunogén aktivitásra nézve ellenőrizhetjük. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltejük, a korlátozás szándéka nélkül. 1. példa Pulyka rhinotracheitis (TRT) vírus legyengitése csirkeembrióban és légcső szövettenyészetben végzett váltakozó passzálással A szövettenyészeten szaporított vírust az allantoisz üregen át 9 napos csirkeembriókba inokuláljuk. Az allantoisz folyadékot 4 nappal később kinyerjük és légcső szövettenyészetbe inokuláljuk. A szövettenyésztő folyadékot 3 nappal később kinyerjük és 9 napos embriókba inokuláljuk az allantoisz üregen keresztül. Embriókban és szövettenyészetekben 25-ször végzett váltakozó passzálás után in vivo vizsgáljuk a legyengítést. Két, 8-8 darab 4 hetes pulykából álló csoportot inokulálunk intranazálisan vagy a szülő, vagy a származék törzzsel. 21 nappal később mindkét csoportból vért veszünk és intranazálisan fertőzzük a szülőtörzzsel. Az eredményeket az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat Orrgennyesedés (napok száma a fertőzés után) TRT semlegesítő antitest titer, 21 nappal később (reciprok) Klinikai légúti betegség a szülőtőrzzsel végzett fertőzés után Inokolum 4 5 6 7 Szülőtörzs* 5/8 7/8 8/8 7/8 56; 56; 56; 69; 83; 95; 125; 166 átlag-88 Nincs 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
