203671. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a nyulak vírus okozta vérzéses betegsége (rabbit haemorrhagic disease, RHD) elleni inaktivált, adjuvált oltóanyag előállítására
1 HU 203 671 B 2 tani és eredménye 94%-ot meghaladó korrelációt mutatott a kórszövettani vizsgálat eredményével. Magunk ELISA próbát is kidolgoztunk, a szervanyagok vírustartalmának és a savó ellenanyagtartalmának mérésére. A beteg állatok nem gyógyíthatók. A védekezés legfontosabb feladata a fertőzés- behurcolásának a megakadályozása. Járványgócok jelentkezésekor szigorú igazgatási intézkedésekkel, beleértve a beteg és fertőzött állatok leölését, valamint szigorú zárlattal való védekezést alkalmaztak eddig a betegség terjedése ellen. Az igazgatási rendszabályok, az állami kártalanítás melletti leölés, a zárlati intézkedések magas költséggel járnak, de ennél sokkal nagyobb veszteséget jelent a nyúlhús és prém értékesítéséből származó gazdasági eredmények elmaradása. Az állomány megóvása érdekében célravezetőbbnek látszik a nyulak immunizálása. A találmány célja a nyulak vírus okozta vérzéses betegsége elleni inaktivált, hatékony vakcina előállítása. A vakcinával szembeni követelmények, hogy- a fogékony korú, 4 hetesnél idősebb nyulak számára ártalmatlan legyen, beleértve a vemhes és szoptatós anyanyulakat és a hím tenyészállatokat,- a fogékony korú, 4 hetesnél idősebb nyulaknak egyszeri immunizálás útján legalább 6 hónapig hatékony védelmet adjon a betegség ellen. A találmány alapja az a meglepő felismerés, hogy a virulens vírustörzzsel megfertőzött és elhullott nyulak belső szerveiből készített szuszpenzióból olyan oltóanyag állítható elő, amely tartós védelmet nyújt a nyulak vírus okozta vérzéses betegsége ellen. A találmány eljárása szerint virulens vírustörzzsel nyulakat fertőzünk meg, majd a betegségre jellemző tünetek mellett elhullott nyulak májából homogén szuszpenziót készítünk, feltárjuk, centrifugálással tisztítjuk és vírustartalmát haemagglutinációs próba segítségével meghatározzuk. A kapott nyersvírussal nyulakat fertőzünk meg és azok elhullása után májukat az előzőekben ismertetettel azonos módon feldolgozzuk. Az így kapott tisztított máj alapanyagot formaldehiddel vagy etiléniminnel inaktiváljuk és alumíniumhidroxid géllel, vagy inkomplett olajos immunadjuvánssal adjuváljuk. Az eljáráshoz alkalmazott vírustörzs a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél RHDV 1/2 jelzéssel NGAIM V (P) 001078 szám alatt 1989. 01. 18-án letétbe helyezésre került. A találmány szerint előállított vakcina kiváló immunizáló hatása több tényezőre vezethető vissza. A felhasznált vírustörzset több, hazai járvényesetekből izolált törzs közül választottuk ki, biztos fertőzőképessége és a máj homogenizátum magas haemagglutinációs titere alapján. Az alkalmazott adjuválási eljárások, az antigén - adjuváns arányának előnyös megválasztása olyan hatékony vakcinákat eredményeznek, melyek még 1/10 adagban alkalmazva is teljes védelmet adnak a virulens vírus 1000-10 000 halálos adagjával (LD50) végzett felülfertőzéssel szemben. A találmány szerinti eljárással nagyüzemi méretekben olyan inaktivált vakcina állítható elő, amely ártalmatlan, és hatékony specifikus védelmet nyújt a nyulak vírus okozta vérzéses megbetegedése ellen és amely más, ismert inaktivált vakcinákkal kombinálható. Kombinált vakcina állítható elő a találmány szerinti eljárással készített oltóanyag és a Phylaxia által gyártott nyulak pasteurellózisa elleni vakcina egyszerű összekeverésével. A találmányt a következő példákkal világítjuk meg anélkül, hogy oltalmi körét azokra korlátoznánk. 1. példa Az oltóvírus előállítása Hazai járványesetből izolált, a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményénél NCAIM V (P) 001078 sz. alatt letétbe helyezett virulens vírussal a nyulak vérzéses betegsége iránt fogékony, 2-2,5 kg tömegű nyulakat fertőzünk intravénásán vagy intraperitoneálisan. A betegségre jellemző tünetek mellett elhullott nyulak májából PBS oldattal [J. Exp. Med. 99, 167, (1954)] 10 %-os szuszpenziót készítünk. A sejthez kötött vírus kiszabadítása céljából a szuszpenziót egy alkalommal -20 °C hőmérsékleten lefagyasztjuk, majd hőmérsékletét 4 °C-ra felengedve felolvasztjuk. A szuszpenziót 4 °C hőmérsékleten 30 percig 2500 xg értékkel centrifugálással ülepítjük, majd a felülúszóból mintát veszünk a haemagglutinációs titer meghatározására. A mintát a térfogatára számított 20% mennyiségű kloroformmal extraháljuk szobahőmérsékleten 30 percig, majd +4 °C hőmérsékleten 30 percig centrifugáljuk 2500 xg-vel. A centrifugálással kapott vizes szuszpenzió haemagglutinációs literét (HA) meghatározzuk az ismert módon („Virology, a practical approach” ERJL Press, Oxford, 1985,129. old.) humán „0”vörösvérsejtekkel. A májszuszpenzió infektív titerét (LD50) fogékony nyulak oltása útján állapítjuk meg. A 10-es léptékű hígítási sorral fertőzött nyulak specifikus elhullása alapján Reed-Muench módszerével meghatározott titemek megfelelően állítjuk be az oltóvírus hígítását 1000 LD50/ml értékre. Az oltóvírust felhasználásig -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A nyersvírus előállítása Az előzőek szerint előállított és ellenőrzött 1000 LD50-nyi oltóvírussal egészséges, 2-2,5 kg tömegű, a betegség iránt fogékony nyulakat fertőzünk meg intravénásán vagy intraperitoneálisan. A betegségre jellemző időn belül (24-96*1) elhullott nyulak máját az 1. példában előírtak szerint feldolgozzuk és HA titerét meghatározzuk. A nyersvírus HA titerét PBS oldattal úgy kell beállítani, hogy az legalább 1:256 érték legyen. Inaktiválás, adjuválás, kiszerelés Az előzőek szerint előállított nyersvírust 0,4 tf% mennyiségű 37%-os vizes formaldehid-oldattal 24 órán át szobahőmérsékleten való kevertetéssel 500 p.g/ml mennyiségű etüéniminnel inaktiváljuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
