203583. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bakteriális fertőzések ellen védő emberi monoklonális antitest-készítmények és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203583B A gram-negatív baktériumok eltérő antigenicitása a lipopoliszacharid (LPS) változó területeinek tulajdonítható. Az LPS olyan molekula, amely a gram-negatív organizmusok külső membránjához társul. AzLPS molekuláról általában úgy vélik, hogy három szerkezeti területből tevődik össze. A külső membránhoz legközelebbi terület az LPS úgynevezett , A” lipid része. Ez a szerkezetileg megóvott terület rendelkezik a gram-negatív betegségekkel társult endotoxikus aktivitással. A második szerkezeti terület, amelyet „belső”-nek (core) nevezünk, az A lipidhez van kapcsolva gyakran 2-keto-3-dezoxi-D- mannooktonát (KDO) gyökön keresztül, és ez a terület az ,A” lipid területhez hasonlóan, általában nem férhető hozzá az antitest számára, amikor az LPS harmadik, legkülső része jelen van. Bár ez a terület részlegesen megőrzött néhány gram-negatív baktérium-fajon belül, több eltérést találtak a teljes „belső” részben az Enterobacteriaceae család tagjai között. Az LPS molekula legkülső területe ismétlődő oligoszacharid egységekből van összeállítva, ez úgy ismeretes, mint O-fajlagos oldallánc. A cukrok ezekben az oligoszacharid egységekben olyan molekuláris egységekből állnak, amelyek szerotípus-fajlagos szerkezeti antigén eltérést mutatnak. így maguk a cukrok, szekvenciájuk és kötéseik meghatározzák az O-oldallánc antigenicitást tercier struktúrájuk révén. Ezekben az O-csoportokhoz szolgáló antigénekről általában úgy találták, hogy szerotípus-fajlagosak. A szerotípusokat tipikusan monospecifikus antiszérumokkal való reaktivitásukkal határozzák meg, amely antiszérumok csak egy bizonyos antigén determinánshoz bírnak kötő aktivitással. Lásd általában Mayer és munkatársai: Meths. Microbiology 18,157-201 (1985). Az LPS „belső” és, A” lipid területei elleni antiszérumokat állítottak elő annak az erőfeszítésnek a keretében, hogy bemutassák a védelem lehetőségét gram-negatív fertőzések ellen (Sakulramrung és Domingue: J. Inf. Dis. 151, 995-1104 /1985/; McCabe és munkatársai: J. Infect. Dis. 1365, 516 119111', és Mullan és munkatársai: Infect. Immun. 10, 1195-1201 /1974/). Nemrégiben áhítottak elő olyan egér- és ember monoklonális antitesteket, amelyek reaktívak a megőrzött területekkel. Bár ezek az antitestek néha részleges in vivo hatékonyságot mutatnak megszokott modell-rendszerekben (Teng és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 1790/1985/; és Bogard és Kung: WO85/01659 közzétételi számú szabadalmi bejelentés), más laboratóriumok nem képesek mutatni hasonló hatásokat, lásd Elkins és Metcalf: Infect. Immun. 48,597 /1985/; és Gigliotti és Shenap: J. Inf. Dis. 151,1005- 1011/1985/). Ezen kívül ezek az antitestek általában nem reagálnak (illetve nem kötődnek) ép, élő gram-negatív baktériumokhoz vagy tisztított LPS molekulákhoz. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az LPS „belső” vagy anti ,A” lipid antitestek nem reagálnak gram-pozitív baktériumokkal, mivel ez utóbbiak nem rendelkeznek LPS-sel. Ennek a felfedezésnek a tükrében valószínűtlen, hogy monoklonális antitestek az LPS megőrzött „belső” vagy, A” lipid eüen hatékonyak lesznek a humán gram-negatív, vagy esetleg gram-pozitív bakteriális betegségek ke5 zelésében. így továbbra is jelentős igény áh fenn olyan humán monoklonális antitestekre, amelyek szélesen (fajok között) kereszt-védő hatásúak gram-pozitív és gram-negatív bakteriális betegségek ellen, valamint szükség van az ilyen antitestek gyakorlati előállítására és alkalmazására. A jelen találmány kielégíti ezeket az igényeket. A találmány szerinti eljárást az alábbiakban foglaljuk röviden össze. Olyan új sejtvonalakat nyújtunk, amelyek a baktériumfajok többségével fajlagosan kereszt-reakcióba lépni képes humán monoklonális antitesteket termelnek, és ahol a kereszt-reakció egy olyan hozzáférhető epitóp kötése révén történik, amely legalább két különböző baktériumfajon jelen levő nem-”belső” szénhidrát részt tartalmaz. Előállítunk továbbá új, bakteriális fertőzések megelőzésére vagy gyógykezelésére alkalmazható gyógyászati készítményeket, amelyek az említett monoklonális antitesteket tartalmazzák, gyógyszerészeti célra alkalmas vivőanyagok és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyagok kíséretében. Ezen kívül a gyógyászati készítmény tartalmazhat még egyet vagy többet az alábbiak közül: további humán monoklonális antitestek, amelyek más baktérium nemzetségekkel képesek reagálni; valamely gamma globulin frakció humán vérplazmából; gamma globulin frakció olyan humán vérplazmából, ahol a plazmát egy vagy több baktérium-nemzetséggel reaktív immunglobulinok emelt szintjét mutató emberből kapjuk; és egy vagy több antimikrobiális szer. Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány jellemző kiviteli módjait. A jelen találmánnyal összhangban humán monoklonális antitestek előállítására képes új sejteket és Uyen antitesteket tartalmazó kompozíciókat nyújtunk, az ilyen kompozíciók képesek szelektíven reagálni olyan baktériumnemzetségek sokaságával, amelyek felelősek a kórházi-, újszülött- vagy más fertőzésekért, és ahol az egyes antitestek tipikusan többféle baktériumnemzetségen jelen lévő, nem „belső” szénhidrát epitópokkal reagálnak. A szóban forgó sejteknek azonosítható kromoszómáik vannak, amelyekben a belőlük vagy egy prekurzor sejtből származó csíravonal DNS (germ-line DNS; haploid számú kromoszómát tartalmazó sejtvonalból származó DNS) átrendeződött, hogy egy antitestet vagy kötő fragmensét kódoljon, amely antitestnek vagy fragmensnek kötő helye van egy olyan antigén determináns (epitóp) számára, amely két vagy több baktériumnemzetség legalább néhány szerotípusán található szénhidrátban részt vesz. Ezeket a humán monoklonális antitesteket nagyon sokféle módon lehet alkalmazni, beleértve a bakteriális betegségek diagnózisát, megelőzését és gyógyítását. Tipikusan a jelen találmány szerinti sejtek olyan sejtek, amelyek képesek egy humán antitest állandó termelésére tenyészetben, elsősorban olyan nempusztulóvá tett humán limfociták, amelyek legalább két baktérium fajban szerepet játszó, hozzáférhető molekulában jelen levő, nem „belső” szénhidrát determinánsok fizikaüag rendelkezésre állnak a felhasználás körülménye közti környezetben a monoklonális antitestekkel való közvetlen kölcsönhatás6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
