203579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fúziós proteinek előállítására
HU 203579B restrikciós enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a (11) jelű nagy fragmenst izoláljuk [3; agaróz-fél]. Ezt követően a két fragmenst (10 és 11) T4-ligázzal a pK 400 jelű, (12) számú plazmiddá ligái juk [4]. Ezt a plazmidot a 2. ábrában kétszer ábrázoltuk; az alsó rajzon a kapható hirudin-származék aminosavszekvenciája látható. A (4) plazmidot (1. ábra) Kpn I és Sal I restrikciós enzimekkel megnyitjuk [1] és a hirudin rész-szekvenciát tartalmazó kis (13) fragmenst izoláljuk [3]. Az 1 a. ábrán (9) számmal jelölt plazmidot Ecor I enzimmel parciálisán vágjuk [1 ], a szabad végeket Klenow-poiimerázzal feltöltjük ("fill in” reakció) [2.1.3], majd Sal I enzimmel vágjuk [ 1 ]. fgy a pK360 plazmid (15) jelű származékot kapjuk. A (3), (13), (14) és (15) fragmenseket ligáivá a 2a. sz. rajzon kétszer feltüntetett pK410 plazmidot (16) kapjuk; az alsó rajz a fúziós protein, illetve a savval végzett hasítás után kapott hirudin aminosav-sorozatát mutatja. A kifejezés és az 1. példa szerint végzett feldolgozás után új hirudin-származékot kapunk, amely az 1-es és a 2-es helyzetben prolim, illetve hisztidint tartalmaz. Ez a hirudin ugyanolyan aktivitást mutat, mint a 34 29 430 sz. NSZK-beli közrebocsátási iratban ismertetett természetes hirudin, amely az említett pozíciókban treonint és tirozint tartalmaz. Az új hirudin-származék azonban aminopeptidáz enzimekkel szemben ellenállóbb, amiből előnyök adódhatnak az in vivo alkalmazás során. 3. példa A kereskedelmi forgalomban beszerezhető pBR 322 vektort BamH I enzimmel megnyitjuk [ 1 ], A kapott kiegyenesített (17) plazmid szabad végeit dATP, dGTP és dTTP (nuldeotid-trifoszfátok) segítségével feltöltjük, és a túlnyúló G nukleotidot S1 - nukleázzal lebontjuk [2.1.2], így a pBR 322 plazmidot (18) sz. származékát kapjuk. A majom-proinzulinból származó Hae Hl fragmenst (19) (Wetekam és munkatársai, Gene 19 /1982/ 181) a módosított (18) plazmiddal ligáljuk [4], így a pPH 1 (20) plazmidot kapjuk. Az inzulinrészszekvencia a tetraciklin-génben helyezkedik el, ezért a pPH 1 plazmidot tartalmazó kiónok tetraciklinnel szemben nem reziksztensek, és ennek révén azonosíthatók [6.1]. A (20) plazmidot BamH I Dde I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ], és a (21) kis fragmenst izoláljuk [3]. Járulékosan a majom proinzulin szekvenciájából a Dd I és Pvu H vágóhelyek közötti (22) rész különítjük el [1; 3]. Az inzulin (21) és (22) rész.szekvenciáit a megnyitott (23) plazmiddal ligáivá [4] a pPH5 plazmidot (24) kapjuk. Ezt BamHI és Pvu H enzimmel megnyitjuk [1] és a kis (25) fragmenst izoláljuk [3]. Az inzulin szerkezetének kiegészítése céljából a (26) DNS-szekvenciát szintetizáljuk. A kereskedelemben kapható pUC 8 vektort BamH I és Sal I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a (27) maradék plazmidot izoláljuk [3], Ezt a (25) és (26) DNS-szekvenciákkal a (28) pPH 15 plaziddá ligáljuk [4], amelyet Sal I enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.2], A kapott (29) plazmid-származékból Bam H I enzimmel a (30) 7 szekveniát lehasítjuk [ 1 ]. A pUC 9 vektort (kereskedelmi termék) BamH I és Sma I enzimmel megnyitjuk és a nagy (31) fragmenst izoláljuk [1;3], Ezt a fragmenst a (3) DNS- szekvenciával ligáljuk [4], így a (32) pPH 16 plazmidot kapjuk. A (32) plazmidot Sal I enzimmel megnyitjuk, a kapott kiegyenesített (33) plazmidot dCTP, dGTP és dTTP alkalmazásával parciálisán feltöltjük [2,1,3], és a megmaradt T nukleotidot SÍ-nukleázzal lehasítjuk [2.1.2], A kapott (34) plazmidot BamH I enzimmel kezeljük [ 1 ], és a (35) termékből S1 -nukleázzal a túlnyúló GATC-szálat eltávolítjuk [2.1.2], így a (36) plazmidhoz jutunk. A (36) plazmid tompa végeit a (37) pPH 20 plazmiddá ciklizáljuk [4], Kompetens E. coli HB 101 sejteket a ligáit eleggyel transzfomálunk [5] és szelektív táptalajon szélesztünk [6.1]. A kívánt plazmidot tartalmazó kiónok proinzulint exprimálnak: 70 megvizsgált klón közül 28-ban volt radioimmunológiaüag kimutatható proinzulin. A plazmidokat DNS-szekvenciaelemzéssel is azonosítjuk [6.3]. A bennük levő DNS a B-lánc első aminosavjának (Phe) kodonja előtt arginint kódol. A (37) plazmidot Hind Hl enzimmel megnyitjuk [1], a túúlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Dde I enzimmel utóvágjuk [ 1 ]. A kis (38) fragmenst izoláljuk [3]. A 3a rajzon (28) számmal szereplő plazmidot Sál I és Dde I enzimmel megnyitjuk és a kis (39) grafmenst elkülönítjük [1;3]. A (9)plazmidot (la.ábra) először AccI enzimmel megnyitjuk [ 1 ], a szabad végeket feltöltjük [2.1.3] és EcoR I enzimmel részlegesen utóvágjuk. A rövidített 2-IL-szekvenciát tartalmazó (40) fragmenst izoláljuk [3]. A kiegyenesített (3) plazmidot (1. ábra) a (38), (39) és (40) DNS-szegmensekkel ligáljuk [4], A kapott (41) plazmid olyan fúziós proteint kódol, amely a 2-EL 1-114. aminosavja után az Asp-Phe-Met-He- Thr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg szekvenciát tartalmazza. Az arginin mint az áthidaló tag utolsó aminosava lehetővé teszi az inzulinláncok tripszinnel végzett lehasítását. A (9) plazmidból (la. ábra) kiindulva az alábbi úton is juthatunk a (41) plazmidhoz: a (9) plazmidot AccI enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Sal I enzimmel utóvágjuk [1], majd a kapott (42) plazmidszármazékot a (3) és (39) szegmensekkel ligáljuk [4], 4. példa A (6) plazmidot (1. ábra) a Taq I és EcoR I restrikciós enzimekkel megnyitjuk [1] és a (43) kis fragmenst izoláljuk [3]. Ezt a fragmenst a (44) szintetikus DNS-szekvenciával és a (3) és (5) szegmensekkel a (45) pPH 100 plazmiddá ligáljuk [4]. Ez a plazmid olyan fúziós proteint kódol, amelyben a 2TL első 132 aminosava után az Asp-Pro képletű áthidaló tag, majd ezután a hirudin aminosav-szekvenciája következik. A fúziós protein proteolítikus hasítása módosított, biológiailag aktív 2’-IL-t ad (amelyben a 133. helyen Thr helyett Asp van), amellett olyan hirudin-származékot, amely a természetes termék 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
