203579. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fúziós proteinek előállítására
HU 203579B aminosav-sorozata előtt N-terminálisan Pro-t tartalmaz. Ez a termék szintén biológiailag aktív, ugyanakkor proteázokkal szemben a természetes hirudinnál ellenállóbb. A 2’-IL-es fúziós protein biológiai aktivitást mu- 5 tatott olyan sejtproliferációs tesztben, amelyet 2- EL-től függő sejtvonallal (CT 112) végeztünk (D. Stull ésS.Gülis,J. Immunoi. 126,1680-1683/1981/; 91 539 sz. európai szabadalmi leírás 15. oldala). A proteint 6 mólos guanidinium-hidrolklorid-ol- 10 dattal denaturálva, majd puffer-oldattal (10 mM trisz-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA) regenerálva továbbra is nagy 2-IL-aktivitást tapasztaltunk. Emellett a fúziós protein savval és trombinnal kezelt vér alvadási idejét meghosszabbította. A kapott fúziós 15 protein tehát kettős hatású. 5. példa A kereskedelmi forgalomban levő pUC 12 vektort EcoR I és Sac I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a 20 kapott (46) kiegynesített plazmidba olyan 2-IL-rész szekvenciát ültetünk be [4], amelyet a 6 plazmidból (1. ábra Eco Rí és Sac I enzimekkel kivágtunk. A (47) szekvencia a 2-IL első 94 aminosavjának komplett triplettjeit tartalmazza. A (46) és (47) 25 fragmenseket ligáivá [4] a (48) pK 300 plazmidot kapjuk. A (9) plazmidot (la. ábra) Eco Rí enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Hind IH enzimmel utóvágjuk [ 1 ]. A hirudint kódoló 30 szekvenciát követően a pUC 12 plazmidból származó polüinker egy részét tartalmazó kis (49) fragmenst izoláljuk. A (48) plazmidot Sma I és Hind Hl enzimmel megnyitjuk [1] és a nagy (50) fragmenst izoláljuk 35 [3]. A (49) és (50) fragmenst ligáljuk az (51) pK 301 plazmiddá [4]. A ligáit eleggyel kompetens E. coli 294 sejteket transzformálunk [5]. Az (51) plazmidot tartalmazó kiónokat restrikciós elemzéssel [6.2] azonosítjuk; 40 olyan DNS-t tartalmaznak, amely a 2-IL első 96 aminosavjának kodonjait követve 6 aminosavból ál9 ló áthidaló tag kodonjait, majd a hirudin kodonjait tartalmazza. Az (51) plazmidot Eco Rí és Hind ül enzimmel megnyitjuk. A kapott kiegyenesített (53) plazmidot az (52) DNS-szekvenciával ligáljuk [4], így az (54) pK 370 plazmidot kapjuk. Ha az (54) plazmidot az 1. példa szerinti módon E. coli sejtekben kifejezzük, olyan fúziós proteint kapunk, amely a 2-IL első 96 aminosavját követően az Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr képletű áthidaló tagot, majd utána a hirudin aminosav-szekvenciát tartalmazza. 6. példa A (41) plazmidból (3. példa; 3a. ábra) az Eco Rí és Hind IQ restrikciós enzimekkel a majom-proinzulint kódoló DNS-szegmenst kivágjuk [ 1 ]. A túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3], így az (55) DNS-szegmenst kapjuk. A (48) plazmidot (5. példa, 5. ábra) Sma I enzimmel megnyitjuk [1] és alkálikus marhafoszfátázzál kezeljük [Maniatis fent említett könyve 133. oldala]. Az így kapott kiegyenesített (56) plazmidot az (55) DNS-szegmenssel ligáljuk az (57) plazmiddá [1]. A ligáit eleggyel E. coli 294 sejteket transzformálunk [5], és a kívánt plazmidot tartalmazó kiónokat először restrikciós elemzéssel [6.2], majd a plazmid-DNS szekvencia-elemzésével [6.3] azonosítjuk. Az (57) plazmidból Eco Rí és Hind IH enzimmel a 2-IL-t és a majom-proinzulint kódoló (58) szegmenst kivágjuk [1], A (2) plazmidot (1. példa, 1. ábra) szintén Eco Rí és Hind 1H enzimmel megnyitjuk, és az így kiegyenesített (53) plazmidba az (58) szegmenst belelifáljuk [4]. így az (59) pKH 101 plazmidhoz jutunk. Az 1. példa szerint exprimálva olyan fúziós proteint kapunk, amely a 2-IL első 96 aminosavja után 14 aminosavból álló áthidaló tagot (az 58 DNS- szegmens Y-ját), majd a malomproinzulin aminosav-szekvenciát tartalmazza. 10 I. sz. melléklet: a 2-interleukin aminosav-sorozata Triplett sorszáma 0 1 2 aminoav Met Alá Pro nukleotid sorszáma 1 10 kódoló szál 5’ AA TTC ATG GCG CCG nem kódoló szál 3’ G TAC CGCKJC 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 30 40 ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC 13 1415 16 17 18 19 20 21 22 Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 50 60 70 CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC : CTG GAC GTC 6
