203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 Hü 203 578 B 2 A jelen találmány egy új, carG-nek nevezett karbomicin bioszintetikus génnel, a cargG gén alkalmazási módszereivel, az új gént tartalmazó rekombináns DNS klónozó vektorokkal és az új vektorokat tartalmazó transzformánsokkal foglalkozik. A Streptomyces thermotolerans (ATCC 11416) törzs karbomicint termel, amely 16 tagú ciklusos laktonból és két cukorgyökből áll. A karbomicin antibiotikus aktivitása, a többi makrolidhoz hasonlóan a fehérje szintézis gátlásának tulajdonítható olyan mechanizmus révén, amely a karbomicinnak a riboszómához való kötődésén alapul. A carG gén kódolja azt az aktivitást, amely a karbomicin 16-tagú ciklusos laktonjának előállításához szükséges. A jelen találmány karbomicin bioszintetikus gén kifejező vektorokat nyújt Streptomycesben és más gazdasejtekben való felhasználásra. A rekombináns DNS technológia fejlődését és művelését Streptomycesben az a kívánság hajtja előre, hogy javítsák ezeknek az iparilag fontos organizmusoknak az antibiotikum-termelő képességét nem csupán az antibiotikum kitermelés növelése érdekében, hanem új antibiotikumok előállítása érdekében is. Ezt a fejlődést valamelyest hátráltatja a jelenleg rendelkezésre álló olyan antibiotikum bioszintetikus gének kis száma, amelyek rekombináns DNS technológia segítségével Streptomyces módosítására felhasználhatók. A jelen találmány hasznos és különösen fontos abban, hogy kiterjeszti az ilyen alkalmazáshoz megfelelő antibiotikum biosztintetikus gének számát. A jelen találmány szerinti vektorok különösen hasznosak, mert a vektorokat sokféle Streptomyces sejtjeibe lehet bevezetni és ki lehet választani a transzformánsokat. A klinikailag fontos antibiotikumok felét a Streptomyces szolgáltatja, így kereskedelmileg igen fontos csoport. A jelen találmány új és hasznos vektorokat és módszereket nyújt, de nem csupán ahhoz az iparilag fontos csoporthoz, hanem más antibiotikum-termelő organizmusokhoz is, és lehetővé teszi a karbomicin termelését fermentációval, valamint lehetővé teszi új antibiotikumok és antibiotikum-származékok előállítását. A jelen találmány céljaira, amint ezt a későbbiekben leírjuk és igénypontokba foglaljuk, az alábbi kifejezéseket határozzuk meg. AmR—az apramicin rezisztencia átadó gén Antibiotikum — mikroorganizmusok által termelt anyag, amely, akár természetes formában vagy korlátozott módosítással, gátolja más mikroorganizmusok vagy eukarióta sejtek növekedését, vagy elpusztítja azokat. Antibiotikum bioszintetikus gén —DNS szegmens, amely egy vagy több olyan aktivitást kódol, amely a primer metabolitok antibiotikumokká való átalakításának biokémiai folyamatához szükséges. Antibiotikum bioszintetikus út — antibiotikum bioszintetikus gének teljes készlete, amely a primer metabolitok antibiotikumokká való átalakításának folyamatához szükséges. Antibiotikum-termelő organizmus — bármilyen organizmus, pl. (a korlátozás szándéka nélkül) Actinoplanes, Actinomadura, Bacillus, Cephalosporium, Micromonospora, Penicillium, Nocardia vagy Streptomyces, amely vagy antibiotikumot termel, vagy tartalmaz olyan géneket, amelyek, ha kifejlődnek, antibiotikumokat termelhetnek. Antibiotikum rezisztencia átadó gén — DNS szegmens, amely olyan enzimes vagy más aktivitást kódol, amely antibiotikumra való rezisztenciát biztosít. ApR- az ampicillin rezisztencia átadó gén Bifunkcionális klónozó ingázó vektor — rekombináns DNS klónozó vektor, amely replikálódni és/vagy integrálódni képes két különböző faj organizmusaiba. Klónozás — egy DNS szegmens beépítésének folyamata valamely rekombináns DNS klónozó vektorba és egy gazdasejt transzformálása a rekombináns DNS- sei. carA — A típusú, karbomicin rezisztencia átadó gén carB —B típusú, karbomicin rezisztencia átadó gén carG — DNS szekvencia, amely egy vagy több olyan gént tartalmaz, amelyek a karbomicin 16-tagú, ciklusos laktonjának képződéséhez szükséges aktivitásokat kódolják. cos — a lambda kohézív vég szekvencia. Kozmid — rekombináns DNS klónozó vektor, amely nemcsak replikálódni képes egy gazdasejtben a plazmiddal azonos módon, hanem képes beburkolni magát a fág fejébe. Gén — DNS szekvencia, amely egy promotort és egy kódoló szekvenciát tartalmaz úgy elhelyezve, hogy a promotor ösztönözze a kódoló szekvencia átírását. Genetikai könyvtár — rekombináns DNS klónozó vektorok készlete, amelyekbe a szóban forgó organizmus DNS-ének lényegében mindegyikét tartalmazó DNS szegmenseket klónozták. Hibrid antibiotikum — antibiotikum, amelyet egy gazdasejt természetes formában nem állít elő, de termeli az a gazdasejt, amelyet egy antibiotikum bioszintetikus gént tartalmazó rekombináns DNS vektorral transzformáltak. Hibridizálás — két egyszálú DNS molekula összeforrasztásának folyamata DNS molekula képzésére, amely lehet teljesen bázispáros, de nem teljesen bázispáros is. NmR—a neonácin rezisztencia átadó gén. őri -- egy plazmid replikációs origója. Fazmid — rekombináns DNS vektor, amely működhet fágként vagy plazmidként. Rekombináns DNS klónozó vektor — bármilyen autonóm módon replikálódó vagy integrálódó anyag, beleértve (de nemcsak erre korlátozva) a plazmidokat, amelyek előreviszik egy géntennék, pl. mRNS, tRNS, rRNS, és az mRNS transzlációja után, egy fehérje kifejeződését egy gazdasejtben. Rekombináns DNS vektor — bármilyen rekombináns DNS klónozó vagy kifejező vektor. Restrikciós fragmentum—bármilyen lineáris DNS molekula, amely egy vagy több restrikciós enzim működése következtében alakult ki. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
