203578. lajstromszámú szabadalom • Eljárás Streptomycesben és más organizmusokban alkalmazható carG karbomicin bioszintetikus gén előállítására
1 HU 203 578 B 2 rRNS—riboszomális ribonukleinsav. Érzékeny gazdasejt — gazdasejt, amely nem képes nőni egy adott antibiotikum jelenlétében egy olyan DNS szegmens nélkül, amely arra az abtibiotikumra rezisztenciát ad át. TcR — tetraciklin-rezisztens fenotípus vagy az azt átadó gén. Transzduktáns — befogó gazdasejt, amelyet transzformációnak vetettünk alá rekombináns fág fertőzéssel. Transzfarmáns — befogadó gazdasejt, amelyet transzformációnak vetettünk alá. Transzformálás — DNS bevezetése valamely befogadó gazdasejtbe, amely bevezetés megváltoztatja a genotípust és változást eredményez a befogadó sejtben. tsrR — a tiosztrepton-rezisztens fenotípus vagy az azt átadó gén. A bejelentéshez tartozó, alább ismertetett ábrák léptékben vannak ábrázolva; a megfigyelt restrikciós fragmentum méret azonban eltérhet valamelyest a térkép távolságain alapuló kalkulált mérettől. Néhány restrikciós enzimnél, pl. Mbol-nél, csak bizonyos hasítási helyeket tüntetünk fel a jobb áttekinthetőség miatt. Az 1. ábra a pOJ171 plazmid restrikciós hely- és működési térképe. A 2. ábra a pOJlóO plazmid restrikciós hely- és működési térképe. A 3. ábra a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és működési térképe. A jelen találmány új karbomicin bioszintetikus génnel foglalkozik, ezt carG-nek nevezzük, ezt fel lehet használni az antibiotikum kitermelés fokozására és új antibiotikumok előállítására. A carG gén hasznos egy karbomicin-termelő organizmus képességének fokozására alkalmas módszerben, amely módszer abban áll, hogy a carG géntermék kifejeződését kódoló rekombináns DNS vektorral az organizmust transzformáljuk, és a transzformált sejtet karbomicin-termelésre alkalmas körülmények között tenyésztjük. A módszer különösen előnyös a Streptomyces thermotolerans gazdasejt karbomicin-termelő képességének fokozására. A carG gént a pOJ171 plazmidból lehet izolálni a ~14 kb-sBgin restrikciós fragmentumban; a pOJ171 plazmidot azE. coliK12SF8/pOJ171 törzsből lehet izolálni, ez a törzs letétbe van helyezve az Agricultural Research Service [Northern Regional Research Center (NRRL), Peoria, Illinois 61604] állandó törzsgyűjteményében és annak részét képezi NRRL B-18169 letéti számon. A pOJ 171 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábrában mutatjuk be. A pOJ171 plazmid hasznos kiindulási anyagként szolgál más olyan vektorok megalkotásához, amelyek tartalmazzák a carG karbomicin bioszintetikus gént. így pl. a pOJ171 plazmid -14,0 kb-s BglII restrikciós fragmentumát, amely tartalmazza a karbomicin bioszintetikus gént, izoláljuk, és BgUI-vel emésztett pOJ160 plazmidba (NRRL B-18088) iktatjuk, így alakítjuk ki a pOJ325 és pOJ32SA plazmidokat, amelyek csak a -14,0 kb-s, karbomicin bioszintetikus gént tartalmazó BglII restrikciós fragmentum orientációjában különböznek. A pOJ325 és pOJ325A plazmidok előállítási munkamenetét a 2. példában adjuk meg; a pOJ325 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 3. ábra adja meg. A carG-t tartalmazó jelen találmány szerinti -14 kb-s Bgin restrikciós fragmentum valójában egynél több gént tartalmazhat. A carG gén aktivitását legjobban úgy lehet megérteni, hogy meghatározzuk azt a mutációt, amelyet a carG gén kiegészít. A Streptomyces thermotolerans bizonyos mutánsai, mint pl. az NRRL 15270, amelyet a 4 522 919 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet, nem termel karbomicint vagy karbomicin-rokonvegyületeket, hacsak nem egészítjük ki a karbomicin vagy hasonló antibiotikumok 16-tagú ciklusos laktonjával. A jelen találmány szerinti carG gén azt az enzimes aktivitást kódolja, amely ahhoz szükséges, hogy az olyan organizmus, mint az NRRL 15270, képes legyen karbomicint termelni a 16-tagú ciklusos lakton hozzáadása nélkül. A jelen találmány módszert nyújt hibrid antibiotikum termelésére is valamilyen gazdasejtben, a módszer abban áll, hogy egy gazdasejtet olyan rekombináns DNS vektorral transzformáljuk, amely előreviszi a carG géntermék kifejeződését, és a transzformált gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amely a hibrid antibiotikum előállítgásához alkalmas. A módszer különösen alkalmas makrolid-termelő gazdasejtekhez, elsősorban a Streptomyces makrolid-termelő törzseihez. A carG gént Streptomyces thermotolerans egy karbomicintermelő törzséből (ATCC 11416) izoláljuk, így a S. thermotolerans genomiális DNS-ét részlegesen emésztjük Mbol restrikciós enzimmel és az így létrejövő DNS-t beiktatjuk Hpal-gyel és BamHI-gyel emésztett pKC462A kozmidba, hogy egy sor carG-t tartalmazó plazmidot kapjunk, köztük a pOJ 171-et. A pKC462A plazmid (NRRL B-15973) olyan típusú kozmid ingázó vektor, amelyet a 842,102 bejelentési számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (benyújtva 1986.03.20.) ismertet. A jelen találmány szerinti vektorokat lehet alkalmazni egy sor organizmus transzformálására, hogy növeljük az organizmus karbomicin-termelő képességét vagy lehetővé tegyük, hogy az organizmus szintetizálja a karbomicin 16-tagú ciklusos laktonját, amely hasznos köztes tennék az antibiotikum bioszintézisben. Ezen ldviil a carG gént lehet alkalmazni különböző antibiotikum-termelő organizmusok, különösen makrolid antibiotikum-termelő organizmusok transzformálására abból a célból, hogy új antibiotikumokat állítsunk elő. A carG gént magát lehet rekonstruálni, rekombináns DNS technikát alkalmazva, abból a célból, hogy a carG génterméket állítsuk elő nem Streptomyces fajokban. Az alábbi táblázatok különböző antibiotikum-termelő organizmusok mintáit tartalmazzák, amely organizmusokban a carG gént lehet alkal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
