203565. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kis molekulatömegű heparin, heparán-szulfát, dermatán-szulfát és sóik, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

HU 203 565 B

2

A 13C-NMR spektrumban a 92,7 ppm-nél kapott jel az N-szulfatált glükóz-amin anomer szénatomját jelzi. A 90,9 és a 94,4 ppm-nél jelentkező jelek feltehetően a glükuronsav és az induronsav-2-O-szulfát C1 szénatomjának tudhatók be. 6

5. példa

10 g dermatán-szulfátot (060284 Ac/sol) — amelynek átlagos molekulatömege 50%-ban mintegy 12000 és 50%-ban 25000-nél nagyobb és antitrombotikus 10 aktivitása 21 egység , APTT aktivitása 1,70 és AXa aktivitása 17 U-10 g nátrium-kloriddal és 10 g nátrium-acetáttal együtt 100 ml vízbe öntjük (10 g/100 mles oldat). Az elegyhez adunk 0,45 g réz-acetát-monohidrátot. Amikor a komponensek feloldódtak, az 15 elegyhez 40 perc alatt hozzáadunk 20 ml 24%-os hidrogén-peroxidot, miközben a hőmérsékletet 25-47’C- on, a pH-t nátrium-hidroxiddal 7,6 értéken tartjuk.

A reakcióelegyet további 20 percig keverjük, hozzáadunk 0,5 g EDTA-t és a pH-t ecetsavval 6-ra beál- 20 lítjuk. A depolimerizált terméket 2 térfogat metanollal kicsapjuk. A szilárd maradékot szűréssel összegyűjtjük és 100 ml vízben ismét feloldjuk. Hozzáadunk nátrium-acetátot és 0,45 g EDTA-t, a pH-t 6-ra beállítjuk és a vegyületet ismét metanollal kicsapjuk. 25

A terméket szűrjük és az üy módon összegyűjtött szilárd maradék szárítás után 7,1 g (71% kitermelés)

Ids molekulatömegű dermatán-szulfát. az így kapott terméket kémiai és biológiai analízisnek vetjük alá. A terméket a következő adatok jellemzik: átlagos molekulatömeg: 3000-2800 S%:7,4

uronsavak %- 28,9 S03-eq/COOH-eq-l,4 ”in vitro” aktivitás:

U-APIT: 1 U-AXa:29

”in vivo” antitrombotikus aktivitás: 35.

A 060284 dermatán-szulfátot Cellex D DEAE cellulóz kolonnán a következő körülmények között frakcionálunk, és 0,5 n sósav oldattal aktiválunk:

8 g dermatán-szulfátot 0,1 mólos nátrium-hidroxid oldattal egyensúlyba hozott kolonnán (2,5 x 55 cm) kromatografálunk.

Az eluálást 2-2 liter 0,1 mól/l-es, 0,3 mól/l-es és 1,5 mól/l-es nátrium-klorid oldattal végezzük. Az duátumot töményítjük és a dermatán-szuulfátot két térfogat metanollal kicsapjuk.

A vizsgált frakciókat, a frakciók kitermelési adatait és jellemzőit a 4. táblázatban közöljük.

A 4. ábra LMW-dermatán-szulfát 13C-NMR spektrumát mutatja. Az Aj csúcs az amino-cukor C j - ját,azUj csúcs az uronsav C j-ját jelzi.

4. Táblázat

Frakciók

Kitermelés

%

Molekulatömeg

S%

Uronsav %

so3h/

/COOH

U-APTT

In vitro hatás U-AXa

In vivo hatás antitrombotikus hatás

nemfrakcionált

12000

25000

1.7

17

21

0.1*

26,1

12000

20000

0.3*

21,2

12000

4000

6,9

28,2

1,49

2,6

38

48,7

1.5*

36,7

12000

6,8

28,8

1,42

3,0

28,7

*az elváláshoz felhasznált nátrium-klorid oldat koncentrációja (mól/1)

Depolimerizációval a megfelelő aktivitású oligomereket jó kitermeléssel állíthatjuk elő, egyébként ezek az oligomerek igen alacsony ldtermdéssel és igen időigényes frakcionálással állíthatók dő.

A depolimerizált termékeknek ezenfelül fibrinolitikus aktivitásuk is van.

6. példa

5 g Heparint (átlagos molekulatömege 13 700 dalion) feloldunk 100 ml vízben és 10 g nátrium-acetátot adunk hozzá. Az elegyehez adunk 15 ml 0,32 mólos vas-szulfát oldatot és ezután 40 perc alatt hozzácsepegtetünk 50 ml 5,4%-os hidrogén-peroxidot. A reakcióhőmérsékletet 61 °C-on tartjuk. Az elegy pH-ját

nátrium-hidroxid oldattal 7,5-re állítjuk. A reakcióelegyet lehűtjük, és dekaliton szűrjük. A szűrletet 0,6 g EDTA-hoz adjuk, és a terméket 300 ml metanollal ki- 50 csapjuk. A csapadékot szűréssel összegyűjtjük és 300 ml vízben ismét feloldjuk. Hozzáadunk 0,6 g EDTA-t és 18 g nátrium-acetátot. A keletkezett anyagot 600 ml metanollal kicsapjuk A depolimerizációs terméket szűréssel összegyűjtjük, megszárítjuk és üy 55 módon 4,6 g (92% kitermelés) heparint kapunk, amelynek molekulatömege 7 950.

7. példa

2 g OP 436-7/08 heparán-szulfátot (20 800 mole- 60 kulatömegű) 92 g réz-acetát-monohidráttal együtt

7