203552. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oxetanocin-származékok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
1 HU 203 552 B 2 akcióelegyet 1 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk és a maradékot 7 g szilikagéllel töltött oszlopon ldoroform/metanol 25:1 eleggyel tisztítjuk. Szüikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal (oldószer: kloroform/metanol 10:1) összegyűjtjük a mintegy Rf-0,76 értékű frakciókat, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. így 34 mg (72,4%) (VHb) általános képletű vegyületet kapunk. (2) A (VII c) általános képi etil vegyül et előállítása Nitrogénatmoszférában 80 mg trisz(dimetü-amino)-szulfur-difluor-trimetü-szilikát 0,5 ml vízmentes diklór-metánban felvett oldatát adagoljuk 34 mg (VIIb) általános képletű vegyület 1 ml vízmentes diklórmetánban felvett oldatához és 2,5 órán keresztül - 78 °C hőmérsékleten kevertetjük. Ezután 3 ml vizet adunk hozzá és háromszor 5 ml kloroformmal extraháljuk. A szerves fázist telített vizes nátrium-klorid oldattal mossuk és vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk. Szűrés után az oldószert csökkentett nyomáson ledesztülál juk. A kapott szirup szilikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatával (Merck 57 44, két lemez, kloroform/metanol 10:1) összegyűjtjük a mintegy Rj=0,35 értékű frakciókat és kloroform/metanol 5 : 1, eleggyel üvegszűrőn eluáljuk. Az eluátunot csökkentett nyomáson szárazra párolva 2,8 mg (VHc) képletű vegyületet kapunk. (VHc) képletű vegyület: NMR (400 MHz, CDC13IMS) ppm: 9,09 (1H, br, s, NH), 8,83 (1H, s, 8-H), 8,22 (1H, s, 2-H), 8,04 (2H, d, J=8,2 Hz, Ph), 7,52-7,767 (3H, m, Ph), 6,50 (1H, dd, J=4,8 Hz, 12,8 Hz, l’-H), 6,17-6,36 (1H, m, 2’-H), 4,90 (1H, m, 3’-H), 3,96-4,28 (2H, m) (3) (lO)képletüvegyületelőállítása 2,8 mg (VHc) képletű vegyületet 1,5 metanol és 1.5 ml koncentrált vizes ammónia elegyében oldunk és 2.5 órán keresztül 50 °C hőmérsékleten kevertetjük. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk és a maradékot 80 tömeg%-os vizes metanolban oldjuk és 100 ml, előzetesen a fenti oldószerrel kiegyenlített SephadexLH20 gyantával töltött oszlopon tisztítjuk. Szüikagéles vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal (oldószer: kloroform/metanol 5:1) összegyűjtjük a mintegy Rf=0,5 értékű frakcióiat és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot szilikagéllel töltött oszlopon 20 ml kloroform/metanol 10:1 eleggyel tisztítva 1,0 mg (10) képletű vegyületet kapunk. (10) képletű vegyület: NMR (400 MHz, D20) ppm: 8,39 (1H, s. 8-H,), 8,19 (1H, s, 2-H), 6,64 (1H, dd, J=4,4 Hz, 13,5Hz, l’-H), 5,88-6,07 (1H, m, 2’-H), 4,88-^1,97, (1H, m, 3’-H), 3,92-3,96 (2H, m, 3’-CH2OH) 11 11. példa [A (11) képletű vegyület előállítása] Nitrogénatmoszférában 10 mg nátrium-azidot adunk 32 mg (VHb) képletű vegyület 1 ml vízmentes dimetü-formamidban felvett oldatához és a reakcióelegyet 3 órán keresztül 80 °C hőmérsékleten kevertetjük. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztülálva védett (11) képletű vegyületet kapunk. A védőcsoportok 1-6. példában leírt módon történő eltávolításával 10,7 mg (75,7%) (11) képletű vegyületet kapunk színtelen por formájában. (11) képletű vegyület: NMR (400 MHz, CD30D, TMS) ppm: 8,53 (1H, s, 8-H), 8,23 (1H, s, 2-H), 6,40 (1H, d, J-5,lHz, l’-H), 5,34 (1H, m, 2’-H), 4,63 (1H, m, 3’-H), 3,82-3,98 (2H, m) 12. példa [a (12) képletű vegyület előállítása] (I) 29 mikroliter (42,3 egység) adenozin-dezaminázt (Sigma Co., EC 3.5.4.4.) adunk 20,4 mg (3) képletű vegyület 10,2 ml 0,1 mól/liter koncentrációjú foszfát puff erben felvett oldatához és a reakcióelegyet 5 napon keresztül 27 °C hőmérsékleten kevertetjük. Ezután 30 ml MCI GEL CHP20P gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, az adszorbeált anyagot 90 ml, 20 tömeg% vizet tartalmazó metanollal eluáljuk. Szüikagéles, vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal (Merck, 5715, oldószer: 1-butanol/ecetsav (víz 4:1:2) összegyűjtjük a mintegy Rf=0,40 értékű frakciókat és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztüláljuk. így 19,1 mg (93,2%) (12) képletű vegyületet kapunk színtelen por formájában. (12) képletű vegyület: MS m/z: 239 (M+H)+; NMR (400 MHz, D20) ppm: 8,51 (1H, s, 8-H), 8,13 (1H, s, 2-H), 6,80 (1H, d, J=4,8 Hz, l’-H), 5,23-5,20 (lH,m, 2’-H), 5,10-5,06 (lH,m, 3’-H), 4,07-3,95 (2H, m, 3’ -CH2OH) (13) A (12) képletű vegyület előállítható úgy is, hogy az adenozin-dezamináz helyett üyen enzimet tartalmazó élő sejtet alkalmazunk. 100 ml tápközeget (0,3 tömeg% húsextraktum, 1,0 tömeg% pepton, 0,7 tömeg% nátrium-klorid, pH,-7,0) töltünk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba és autoklávban 20 percen keresztül 120 °C hőmérsékleten sterüizáljuk. A lombikot 1 platinahuroknyi Esherichia coli NIHJ sejttel inokuláljuk és rázás közben aerob körülmények között 18 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten tenyésztjük. 1000 ml tenyészközeget 10000 fordulat/perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáljuk. Az összegyűjtött élő sejteket azonos térfogatú 1/20 mól/liter foszfát pufferrel (pH-7,0) kétszer-háromszor mossuk, majd 100 ml fenti pufferban szuszpendáljuk. Hozzáadunk 50 mg (3) képletű vegyületet és rázás közben 18 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. A reakcióelegyet 5 percen keresztül 100 °C hőmérsékletre melegítjük, majd a fenti módon centrifugáljuk. A felülúszót 50 ml MCI GEL CHP20P gyantával töltött oszlopra visszük, vízzel mossuk és az adszorbeált anyagot 150 ml 20 tömeg% vizet tartalmazó metanollal eluáljuk. Az oldószert csökkentett nyomáson ledesztillálva 46 mg (91,6%) (12) képletű vegyületet kapunk színtelen por formájában. A példában alkalmazott adenozin-dezamináz ke5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
