203373. lajstromszámú szabadalom • Eljárás HIV-ellenes aktivitással rendelkező heparin előállítására
3 HU 203 373 B 4 Az uronsavat (0) a karbazol-reakcióval határozzuk meg (T. Bitter et al., Anal. Biochem. 4, p. 330,1967). Betét-ábra: A HRH (frakciónál! heparin) hatása az RP135 távoli UV-ban észlelhető cirkuláris dikroizmusára (CD). Az RP135 CD értékét (100 pg/ml töménységben) 60 pg/ml HRH távollétében (.-.) és jelenlétében (-) mérjük 10 mM pH 7,4 Hepes pufferben, amely 0,05 M NaCl-t tartalmaz. A heparin kifejezett minimumot indukál 225 nm-en; ez annak tulajdonítható, hogy a peptid-konformációban változás következik be. Maga a heparin elhanyagolható mértékben befolyásolja a CD-t. 2. ábra. JM-sejtek HIV-1 fertőzésének dózistól függő gátlása HRH-val (kitöltött kik), URHrtel (0) és 500,000 molekulatömegű dextrán-szulfáttal (négyszög). A meghatározás alapjául A) a vírus által indukált szincitium-képződés és B) a fermentlé felülúszójában a P24 virion mag-antigénjének koncentrációja szolgál. A GB8 törzs vírusanyagát - amelyet akut módon fölözött JM sejtek sejtmentes táptalajából nyerünk ki - olyan táptalajjal (RPMI 1640, 10% borjúembrió-szérum) hígítjuk, amely a vizsgálandó vegyületet különböző koncentrációkban tartalmazza. 15 percen át szobahőmérsékleten való állás után sejteket adagolunk és ezen a hőmérsékleten végezzük a vírus-adszorpciót, 2 órán áL így a fertőzést megsokszorozzuk; a fertőzés multiplicitása (MOI) 0,001 szincitium-képző egység/sejk A fertőzött sejtekből pelleteket képzünk és ezeket háromszor mossuk foszfátpufferes sóoldattal, reszuszpendáljuk friss táptalajban (amely megfelelő koncentrációkban tartalmazza a vizsgálandó vegyületeket) és szétosztjuk egy 24 helyes szövettenyésztő lemez üregeibe. 3 napi inkubálás után -37 *C-on Olympus CK2 inverz mikroszkóp felhasználásával 4 párhuzamos számlálással meghatározzuk a szincitiumok számát. Ugyanekkor mintát veszünk a tenyészlé felülúszójából és ezt centrifugálissal (200 ford/perc 5 percen át) doítjük. 0,1% Triton X-100-zal való kezelés után az „Abbott core antigen” Elisa-teszttel meghatározzuk a P24 antigén szintjét Dózis-válasz görbéket veszünk fel a gyógyszerkoncentráció logi0 értékével szemben és lineáris regressziós elemzés után mindkét teszt alapján kiszámítjuk az 50%-os tényleges dózist (EDM). 3. ábra. AHIV-1GB8 törzsével fertőzött JM sejtekről készült mikrofényképek; a sejteket 10 pg/ml HRH jelenlétében (B) vagy távollétében (A) inkubáljuk, 3 napon át A módszerek tekintetében a 2. ábrára hivatkozunk. A fenti periódus után az indukált szincitiumok száma lineáris marad, ill. a hígulás észlelhető (az ábrán ez nem látható). A HRH 10 pg/ml koncentrációban teljes védelmet nyújt és a sejtek nem különböztethetők meg a kontrolisejtektől, amelyeket nem fertőztünk meg (ezeket az ábra nem mutatja). A fényképeket Olympus P7-10AK automatikus exponálási rendszer segítségével vettük fel. A végső nagyítás a főábra esetében 200-szoros, míg a betétábra esetében 550-szeres. 4. ábra. A HRH, URHS és egy másik szulfátéit poliszacharid a dextrán-szulfát (500,000) relatív hatékonysága 10 pg/ml (árnyékolt) és 1 pg/ml (sraffolt) koncentrációban. A mérésekhez különböző HIV-törzseket veszünk. A P24 antigén szinteket a következő tenyészetek felülúszó folyadékában mérjük: (A) a GB8 törzzsel fertőzött JM-sejtek, (B) az RP törzzsel fertőzött C8166 sejtek és (Q a HTLV-MB törzzsel fertőzött C8166 sejtek. A módszerek megegyeznek a 2. példával kapcsolatban bemutatottakkal, azzal a különbséggel, hogy a HTLV-inB-vel fertőzött sejtekből a fertőzés után 4 nappal veszünk minták A fertőzés MOI értékét 0,01-0,001 fertőző egység/sejt intervallumban lévőnek határoztuk meg a végponti szincitiumszámot megadó módszerrel. A HRH fokozott vírusellenes hatása valamennyi esetben nyilvánvaló az URHj-tel vagy a dextrán-szulfáttal szemben. A találmányt részletesen a következőkben írjuk le. A heparin egy egyenesláncú poliszulfatált mukopoliszacharidokat tartalmazó heterogén vegyületcsoport, amelynek átlagos molekulatömege 15,000 dalion. A heparin biológiai és gyógyászati szempontból antikoaguláns aktivitása miatt jelentős szerepet játszik. A kereskedelmi heparint szarvasmarha-tüdőből vagy sertésbél-nyálkahártyából állítják elő és ez különböző cukrok polimerjeiből áll, amilyenek a következők:- elsősorban az alfa-L-iduronsav-2-szulfát,- 2-dezoxi-2-szulfamino-alfa-D-glükóz-6-szulfát,- beta-D-glukuronsav,- 2-acetamido-2-dezoxi-alfa-D-glükóz és- alfa-L-iduronsav. A cukrok glikozid-kötésekkel kapcsolódnak össze és az egyes cukrok változó mennyiségben vannak jelen. A találmány szerinti eljárásban bármilyen, a kereskedelemben kapható heparin felhasználható. A szóbanforgó eljárásban alkalmazott szulfátéit poliszáé hand semleges vagy só (pl. nátrium-, kalcium- vagy kálium-só) alakban fordulhat elő. A találmány szerinti eljárással előállított Hl V-ellenes szulfátéit poliszacharid a teljes heparinnak azt a részét vagy frakcióját jelenti, amely a gyantához kötött (I) képletű RP135 pepiidhez affinitást mutat. Feltételezhető, hogy hasonló eredények érhetők el más, az RP135-höz hasonló peptidek alkalmazásával is. Az alábbi táblázatban feltüntettünk bizonyos ismert varianciákat más HIV-izolátumok RP135 tartományában (A. D. Cardin és H. J. R. Weintraub, Arteriosclerosis, 9. p. 21-32,1989). Az (I) általános képletben és a táblázatban lévő rövidítések jelentése a következő: Aminosav 3-betüs rövidítés 1-betűs rövidítés Alanin Alá A Arginin Arg R Aszparagin Asn N Glutamin Gin Q Glutam insav Glu E Glicin Gly G Histidin His H Izoleucin He I Lizin Lys K Fenilalanin Phe F Prolin Pro P Szerin Ser S Treonin Thr T Tirozin Tyr Y 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
