203370. lajstromszámú szabadalom • Eljárás főleg nátriuretikus és diuretikus hatású peptidek és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203370B alkalmazunk. Az aktiválás szimmetrikus anhidridként vagy HOBt-észterként diklór-metánban vagy diklór-metán/DMF elegyben vagy DMF-ben történik. A kapcsoláshoz az aktivált aminosav-származék 2-4 ekvivalensét alkalmazzuk. Abban az esetben, hogyha a kapcsolódás nem teljesen zajlik le, akkor a reakciót megismételjük. Mindkét Cys-maradék kapcsolását diszulfid-hídon keresztül, előnyösen a következő irodalmak valamelyike szerint végezzük: „Perspectives in Peptide Chemistry", Karger Basel 1981,31 -44. old. vagy Schröder, Lübke, „The Peptides”, I. kötet, Academic Press, New York, London, 1965,235-239. oldal. Előnyös, ha az oxidációt levegővel vagy elemi jóddal végezzük. Ha a a-aminocsoport átmeneti védelmére FmocvédŐcsoportot alkalmazunk, akkor a szintézist a Modell 430A automatikus peptid-szintetizálóval (Applied Biosystems termék) a saját szintézisprogrammal végezzük. A szintézist Bachem cég termékén egy p-benzil-oxi-benzil-alkohol-gyantán (S.Wang, J. Am. Chem. Soc. 95,1328 /1973/) végezzük. A gyantát ismert módszerrel (E. Atherton és mtársai J. C. S. Chem. Comm. 1981,336) megfelelő aminosawal észterezzük. Az aminosav-származéknak HOBt észterként történő aktiválását közvetlenül a készülék gyártó által szállított aminosav patronokban végezzük, amikoris az előzőleg bemért aminosav-származék és HOBt vagy HOOBt keverékhez DMF-ben készített diizopropil-karbodiimid oldatot adagolunk. Ugyancsak alkalmazhatunk Fmoc-aminosav-OObt-észtert, amelyet a 8710 76 34.5. számú európai szabadalmi bejelentés szerint állítunk elő. Az Fmoc-védőcsoport lehasítását a reakciós edényben DMF-ban készített 20%-os piperidin oldattal végezzük. Az alkalmazott reaktív aminosav-származék felesleg 1,5-2,5 ekvivalensnyi. Ha a kötés nem teljes mértékben valósul meg, akkor a kapcsolást a Boc-módszerhez hasonlóan megismételjük. Ahhoz, hogy a szerinbe, illetve a treoninba a glükozil-maradékot bevigyük, előzetesen az aminocsoportokat és a karboxilcsoportokat megfelelően védeni kell. Rendkívül kedvezőnek bizonyulnak ebben az esetben azok a védőcsoportok, amelyek katalitikus hidrogénezéssel vagy szekunder aminokkal lehasíthatók. Elsősorban ilyen védőcsoportok a következők: a benzil-típusúak, igya benzil-oxi-karbonil(Z-) vagy a p-nitro-benzil-oxi-karbonil-csoport, amelyet amino védőcsoportként alkalmazunk, és a benzil- (-OBzl) vagy a p-nitro-benzil-észter, amelyet karboxilcsoporthoz alkalmazunk. Szekunder aminokkal a 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-(Fmoc) csoportok hasíthatok le. Különösen kedvezőkéntmutatkozik az Fmoc-L- illetve Fmoc-D-Ser(R’)OBzl katalitikus hidrogénezéssel az Fmoc-csoportok megtartásával szelektíven hasítható. Ez különösen meglepő, ugyanis az utóbbi időben egyre gyakrabban hangoztatják, hogy az Fmoc csoport katalitikus hidrogénezéssel lehasítható (R. Geiger és W. König E. Gross és J. Meienhofer: The Peptides, 3. kötet, 24. oldal, Academic Press, 1981). A találmány szerinti eljárással kapott peptidek ANF (Atrial Natriuretic Factor) analógok. Az ANF olyan peptid, amely emlősök szívében, a pitvarban képződik, és nátriuretikus, diuretikus és érfalra ha5 tó anyag (Currie és mtársa, Science 223,67 (1984): Kangawa, Matsuo, Biochem. Biophys. Rés. Commun.118,131 (1984). Atalálmány szerinti eljárással előállított módosulatok az ANF hatását erősíthetik vagy specifikusan változtathatják. így például a nátriuretikus tulajdonság hatásprofilját és hatástartamát pozitívan befolyásolhatják vagy az érfalra fejtett hatást elnyomhatják, vagy ellentétes hatást is okozhatnak. Ezenkívül a találmány szerinti eljárással kapott peptidek immun moduláló hatásúak, amelyről az emlősök szívének pitvarából izolált peptidek esetében még nem tettek említést. A következőkben leírt receptor-kötési tesztben a találmány szerinti eljárással előállított peptidek biológiai hatásához szükséges kötési erősséget vizsgáltuk. Készítmény szarvasmarha mellékvesekéreg membránból Vágóhídról frissen hozott szarvasmarha mellékvesét (jégen szállított) alkalmazunk. Mellékveséből a vezetékeket eltávolítjuk, és jéghideg A pufferban (5 mmól/1 trisz, 1 mmól/1 MgCl2, 250 mmól/1 szacharóz, 7,4 pH, 0 °C-nál) késsel apróra vágjuk. A szövetet A pufferban Waring Blender-készülékkel homogenizáljuk. Ezután a nagy részeket gélszűrőn eltávolítjuk, és a szűrletet Potter homogenizátorral utánhomogenizáljuk. Ezt követően 3000 x g-n és 4 °C hőmérsékleten 10 percig centrifugáljuk, a nagysűrűségű sejtrészeket elválasztjuk és eldobjuk. A felülúszó plazmamembránt ezután 39 000 g-n 10 percig elválasztjuk és B pufferban reszuszpendáljuk. A B puffer összetétele: 75 mmól/1 trisz, 25 mmól/1 MgCl2, pH- 7,4, 4 *C. Ezt a centrifugálási lépést kétszer megismételjük, majd a plazmamembránt B pufferban 250 mmól/1 szacharózzal szuszpendáljuk, és apránként, amely megfelel 1 g eredeti mellékvesekéreg szövet/ml-nek, folyékony nitrogénben megfagyasztjuk. Több hónapon keresztül - 70 °C-nál történő tárolásnál nem tapasztaltunk a kötés aktivitásban csökkenést. Receptor kötés A kötés vizsgálathoz a membránt felolvasztjuk, 39 000 x g-n 10 percig centrif ugál juk és C pufferban szuszpendáljuk. A C puffer összetétele; 100 mmól/1 NaCl2, 0,1 mmól/1 EDTA-Na2,50 mmól/1 HEPES, pH- 7,4 és 0,2% szarvasmarha szérum albumin, a plazmamembrán szuszpenziót 40 pl/1 aprotininhoz, amely peptidáz inhibitor, adagoljuk. így megakadályozzuk, hogy a rádioaktív jelzésű ligandum (Radioligand) az inkubálási idő során elbomoljon. A kötési vizsgálatot mikroliter lapon 25 ”C hőmérsékleten 30 percig, egyensúly beállításáig végezzük. A kötést a membrán szuszpenzió beadagolásával indítjuk. Az egy mintára jutó végtérfogat 250 pl. A minta összetétele: 14000 cpm radioligandum (125 J-humán-atriás nátriuretikus peptid i-28, (Amersham Buchler, NSZK), amelynek specifikus aktivitása 74 TBq/mmól és egy rész membránprotein, amely a beadagolt radioligandumnak körülbelül 50%-át megköti. A szabad és a kötött r&dioligandumot Skatron sejtgyűjtővel Whatman GF/C üvegszál szűrőn gyorsan leszűrjük. A nem specifikus kötés lecsökkentése érdekében a szűrőt előzetesen 1 óráig 10 pH-jú 3%-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
