203370. lajstromszámú szabadalom • Eljárás főleg nátriuretikus és diuretikus hatású peptidek és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

HU 203370B

vagy aril-alkoholok, olajok, polialkilén-glikol, etilcellulóz, karboxi-metil-cellulóz, poli(vinü-pirrolidon) vagy izopropil-mirisztát. Megfelelő pufferanyagok például a nátrium-klorid, nátrium-borát, nátrium-foszfát, nátrium-acetát vagy a glukonátpufferek. A helyi alkalmazási készítmények egyéb nem toxikus segédanyagot is tartalmazhatnak, például emulgeálható konvertálóanyagokat, nedvesítőanyagokat, így például poli-etilén-glikolt, antibakteriális hatású vegyületeket, például kvatemer ammónium-vegyületeket, benzalkónium-kloridot, fenil-higanysókat, benzil-alkoholt, fenil-etanolt, trietanol-amin-oleátot, tio-szorbitot és egyéb hasonló anyagokat, amelyeket helyi szemgyógyászati készítményekben alkalmaznak. Helyi alkalmazási formaként előállíthatunk szemgyógyászatilag beültethető készítményeket. Ebben az esetben például a hatóanyaghoz vivőanyagként szilárd vízoldható polimert alkalmazunk. Polimerként felhasználhatunk minden vízoldható, nem toxikus polimert, így például cellulózszármazékokat, így metil-cellulózt, nátrium-karboxi-metil-cellulózt, 1-6 szénatomos hidroxi-alkil-cellulózt, így hidroxi-propil-metilcellulózt, akrilsavszármazékokat, így poliakrilsavsókat, etil-akrilátot és poli-akril-amidokat. Ezenkívül alkalmazhatunk például zselatint, keményítőszármazékot, alginátot, pektint, poli(vinil-alkoholt), poli(vinil-pirrolidont), poli(vinil-metilétert), poli(etilén-oxidot) vagy különböző polimerek elegyét. Helyi alkalmazásra megfelelő szilárd beültethető készítményeket közöl a 1524405 számú angol szabadalmi leírás.

9

A leírásban alkalmazott rövidítések jelentése Az aminosav megnevezésére alkalmazott rövidítések megfelelők a peptidkémiában szokásosan alkalmazott három betűkódnak, amelyet a J. Biochem. 138, 9 (1984) irodalmi helyen közölnek. Az egyéb rövidítések jelentései:

Acm acetamido-metil

g-Ahx e-amido-hexanoil

Aoc cisz, endo-2-azabiciklo

[3.3.0]oktán-3-S-karboni! Boc terc-butil-oxi-karbonil

But terc-butil

Bzl benzü

Cl-Z 4-ldór-benzil-oxi-karbonil

DMF dimetil-formamid

Dnp 2,4-dinitro-fenil

Fmoc 9-fluorenil-metü-oxi-karbonil

Mac merkapto-ecetsav

Mbu merkapto-vajsav

Me metü

4-Mebzl 4-metil-benzil

Mpr merkapto-propionsav

Mtr 4-metoxi-2,3,6-trimetil-fenil-szulfonil

Mts mezitilén-2-szulfonil

TFA trifluor-ecetsav

Tcs 4-metil-fenil-szulfonil

Trt tritil

A következő példákban anélkül, hogy a találmányt ezekre korlátoznánk, a találmány szerinti eljárással kapott peptidek szilárdfázisú szintézisére néhány előnyös módszert közlünk.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

10

1. Referenciapélda

A

H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Ile-Glu-Arg- Ile-Gly-Ala- |_____

14 24 |-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH

képletű nátriuretikus, diuretikus és érfalra ható ANF-származékok szintézisét Modell 430A automatikus peptid szintetizáló berendezéssel (Applied Biosystem termék) Boc-Tyr(Br-Z)-OH-val szubsztituált4-(hidroxi-metü)-fenü-acetamido-metil-polisztirol-gyantán (Applied Biosystem termék) Bocmódszerrel végezzük. A gyanta 0,5 mmól tirozint tartalmaz. A szintézishez ugyancsak az Applied Biosystem által gyártott aminosav-származékokat alkalmaztuk. A következő aminosav-származékokból 2 mmól-t mértünk mindenegyes patronba, mielőtt a peptid szintetizáló berendezésbe helyeztük volna: Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ser(Bzl)-LH, Boc-Asn-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ile-OH, Boc- Glu(OBzl)-OH. A szintézishez a készülék előállító által javasolt programot alkalmaztuk, amelyet a következőkben sorolunk fel:

1) 65% trifluor-ecetsav/diklór-metán, 5 ml, 2 perc,

2) 65% trifluor-ecetsav/diklór-metán, 5 ml, 15 perc,

3) diklór-metánnal történő mosás (3x10 ml)

4) DMF-ben készített 10%-os diizopropü-etilaminnal történő mosás (2x10 ml)

5) DMF-fel mosás (3x10 ml)

6) Szimmetrikus anhidridként vagy HOBt-észter előaktivált aminosav-származék kapcsolása (15- 30 perc), esetleg ismétlés, ha a kapcsolás nem teljesen zajlott le.

7) diklór-metánnal mosás (6x10 ml)

A szintézis befejezés után a peptid gyantát vákuumban molekulaszita felett szárítjuk. A gyantáról a peptidet lehasítjuk, amikoris a Protein Research Foundation, Minowa, Osaka, Japán cég által gyártott HF-berendezés reakcióedényébe 1 g peptid gyantát 0,5 g p-krezollal és 0,5 g p-tio-krezollal bemérünk, és a berendezést evakuáljuk, majd szárazjég hőmérsékletnél hozzádesztillálunk körülbelül 10 ml hidrogén-fluoridot. Ezután a reakcióelegye 1 órán keresztül 0 'C hőmérsékleten reagáltatjuk, majd óvatosan ledesztilláljuk vákuumban a felesleges hidrogén-fluoridot. A visszamaradó sárgásvörös gyanta-peptid elegyet többször etil-acetáttal és vízmentes éterrel mossuk, így a kationfogót eltávolítjuk. A reakcióelegyet megszárítjuk, majd a peptidet 30%-os vizes ecetsavval a gyanta mellőkkiextraháljuk, és az így kapott nyers peptid oldatot fagyasztva szárítjuk.

A fagyasztva szárított nyers peptidet SephadexR G25-ön 1 n ecetsavval elválasztjuk az esetleg még meglévő kationfogóktól, és a peptidtartalmú frakciókat tovább feldolgozzuk. További feldolgozásnál a nyers peptidet feloldjuk trifluor-etanolban és egy éjszakán keresztül ötszörös feleslegű tri-(n-butil)foszfinnal redukáljuk. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot többször etil-acetáttal extraháljuk, és a csapadékként előállított nyers pep-6