203370. lajstromszámú szabadalom • Eljárás főleg nátriuretikus és diuretikus hatású peptidek és az azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 203370B dáljuk. 0,5 mmól pepiidet feloldunk 50 ml 90%-os ecetsavban, és az oldatot gyorsan 450 ml 80%-os vizes ecetsavban oldott 1 mmól nátrium-acetáthoz és 0,5 mmól elemi jódhoz (erősen összekevert oldat) csepegtetjük. A reakcióelegyet 10 percig keverjük, majd az oldathoz adunk 0,1 n vizes aszkorbinsavat, így az oldat elszíntelenedik, ezután körülbelül 10ml-re bepárol juk, és rögtön SephadexG25-ön 1 n vizes ecetsawal (eluens) sómentesítjük. A peptidet tartalmazó frakciókat összeöntjük és fagyasztva szárítjuk. A tisztaság vizsgálatát Vydac^Ci 8 illetve a Vydac^C4-kolonnán HPLC módszerrel acetonitril 0,1%-os vizes trifluor-ecetsavas oldatával, gradiens elúcióval vizsgáljuk. Nagymértékű tisztítást érünk el, hogyha ugyanazt a vivőanyagot ugyanazzal az eluenssel preparatív HPLC-elválasztjuk. 2. Referencia példa 1 14 H-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Lys-Ile-Asp-Arg- Ile-Gly-Ala-Gln-1___ 15 I 24-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH képletű nátriuretikus, diuretikus és érfalra ható peptidet Modell 430A (Applied Biosystems termék) peptid-szintetizátorral Fmoc-módszerrel Fmoc- Tyr(Bu')-OH-val észterezett p-benzil-oxi-benzil-alkohol-gyantán (Bachem termék, 0,40 mmól/g gyanta a terhelés) fokozatosan felépítjük. A gyantából 1 g-ot alkalmazunk, és a szintézist az Fmoc-módszerre módosított szintézisprogrammal végezzük. A következő aminosav-származékokat alkalmazzuk: Fmoc-Arg(Mtr)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc- Ser(Bu')-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Cys(Acm)OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln- OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc- Asp(OBul)-OH és Fmoc-Lys(Boc)-OH. A szintetizátor patronjaiba 1-1 mmól aminosav-származékot 1,5-2,5 ekvivalensnyi HOBt-vel bemérünk. Az aminosavak aktiválását közvetlenül a patronokban 4 ml dimetil-formamidban történő oldással és 0,55 moláris dimetil-formamidban készített N.N’-diizopropil-karbodiimiddel végezzük. Jellegzetes szintézisciklus a következő: 1) Az Fmoc-csoportokat 20%-os piperidinnel (dimetil-formamidban készített oldat) lehasítjuk (2x8 ml, 10-10 perc) 2) Dimetil-formamiddal mosás (6x8-8 ml dimetil-formamiddal) 3) A patronokban lévő HOBt-észterként előaktivált aminosav-származékok kapcsolása (25-45 perc), esetleg ismétlés, ha a kapcsolás nem ment teljesen végbe 4) Dimetil-formamiddal mosás (6x8-8 ml dimetil-formamiddal). Amikor a szintézist befejezzük, peptidgyantáról először az Fmoc-védőcsoportot hasítjuk le. Ehhez dimetil-formamidban készített 20%-os piperidint alkalmazunk, majd a dimetil-formamiddal jól átmosott gyantát izopropanollal és metil-terc-butiléterrel többszörösen kezeljük, így a gyantát zsugorítjuk. Nagyvákuumban szárítjuk, majd a peptidet 11 szobahőmérsékleten 4 óra alatt trifluor-ecetsav/diklór-metán/fenol (70:30:5) eleggyel állandó keverés közben a gyantáról lehasítjuk. Trifluorecetsav/fenol/dimetil-szulfid (90:5:5) eleggyel végzett utókezeléssel a peptidről lehasítjuk az esetleges megmaradt védőcsoportokat. Ezután a gyantáról leszűrjük, a peptidet tartalmazó oldatot a hasításhoz alkalmazott oldattal utánmossuk és a szűrletet vákuumban bepároljuk. Etil-acetáttal többször összekeverjük, így a kationfogót eltávolítjuk. Nagyvákuumban megszárítjuk, és a nyers peptidet Sephadex G25-ön In vizes ecetsavval az esetlegesen meglévő kationfogóktól és trifluor-ecetsav-nyomoktól elválasztjuk. A peptidtartalmú frakciókat fagyasztva szárítjuk, majd tovább feldolgozzuk. A cisztein Acm-védőcsoportjainak oxidativ lehasítását Kamber és mtársai által a Helv. Chim. Acta, 63, 899 (1980) irodalmi helyen közölt módon 90%-os vizes ecetsavban 50-szeres feleslegben lévő elemi jóddal 15 perc reakcióidő alatt végezzük el. Az így kapott nyers peptid sótalanítása és végső tisztítása az 1. példában leírt módon történik. 3. Referencia példa [dez-Tyr , dez-Arg j-r-Altriopeptin UI-(4- amino)-butil-amid szintézise A peptidszintézist az EP 264 802 sz. alatt publikált európai szabadalmi bejelentésben leírt gyanta 1 g-jával Fmoc-aminosav-OObt-észterekkel Modell 430A automata peptidszintetizáló berendezéssel (Applied Biosystems termék) és a saját módosított szintézis programunkkal végezzük. A szintézisben a gyártó által adott patronokba bemérünk 1 mmól megfelelő aminosav-szánnazékot; Fmoc-Arg(Mtr)-OH-t, Fmoc-Asn-OH-t, Fmoc-Gln-OH-t és 1,5 mmól HOBt-t. Ezeknek az aminosavaknak az előaktiválása a patronokban történik 4 ml dimetil-formamid oldatban, és dimetilformamidban készített 0,55 M diizopropil-karbodiimid oldat 2 ml-ével. A HOObt-észtert feloldjuk 6 ml dimetil-formamidban, és ezután ugyanúgy, mint az in situ előaktivált aminosavakat, arginint, aszparagint és glutamint pumpálunk az előzetesen dimetil-formamidban oldott 20%-os piperidinnel szabaddá tett gyantára. Az in situ aktivált aminosavakat kétszeresen kapcsoljuk. A szintézis befejezése után a peptid-butilé-amidot a gyantáról lehasítjuk, amikoris egyidejűleg tioanizolt és m-krezolt (kationfogó) tartalmazó trifluor-ecetsawal eltávolítjuk az oldalláncon lévő védőcsoportokat. A trifluor-ecetsav leszívatása után kapott maradékot etil-acetáttal többször digeráljuk és centrifugáljuk. A visszamaradó nyers peptidet trifluor-etanolbaii tributil-foszfinnal kezeljük, így a cisztein védőcsoportjait eltávolítjuk. Az oldószert eltávolítjuk, majd a maradékot ismét etil-acetáttal digeráljuk és centrifugáljuk. A redukált nyersterméket rögtön 80%-os vizes ecetsavban jóddal oxidáljuk, a jód felesleget aszkorbinsawal eltávolítjuk és a kis térfogatra bepárolt reakcióelegyet Sephadex G25-ön vizes 1 n ecetsavval sómentesítjük. A tiszta peptidet tartalmazó frakciókat összeöntjük és fagyasztva szárítjuk. 12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
