203367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropinok kinyerésére híg vizes oldatból
HU 203367B 10,8-as pH-jű puff erben oldottuk, az oldat pH-ját 2 n sósavval 9,5-re állítottuk be, és a térfogatot 9,5- es pH-jú pufferrel a kívánt értékre egészítettük ki. Egy 10-es patkánycsoport szolgált negatív kontrollként, és ezeknek az állatoknak a szomatotropin 5 oldására használt hordozót adtuk injekció formájában. Egy második csoport liofilizált A7rpST-oldatot kapott. A további csoportoknak a találmány szerinti, átmeneti fémmel kicsapott A7rpST kiválasztott dózisainak oldatát adtuk injekció formájában. A 10 patkányokat az 1., 2., 9. és 10. napon mértük, és a testtömegüket feljegyeztük. A vizsgálati időszak vé9 gén, a 10. napon a patkányok tömeggyarapodására vonatkozó adatokat analizáltuk. A hipofízis nélküli patkányokkal, egyetlen 14 (jig-os napi dózissal végzett növekedési vizsgálat azt mutatta, hogy a cink-kloriddal kicsapott A7rpST szignifikáns (P,01) növekedésserkentő hatást fejtett ki a kontroll csoporthoz viszonyítva, és a hatása az átmeneti fémionokat nem tartalmazó liofilizált A7rpST hatásától megkülönböztethető volt. Hasonló eredményeket figyeltünk meg a réz(II)-kloriddal való kicsapás esetében is. 10 IV. táblázat Minta Dózis (p,g) Százalékos tömeggyarapodás átlag ± állandó eltérés Negatív kontroll A7 rpSI (ZnCl2-vel 0 4,0 4,1 kicsapva) A7rpST(CuCl2-vel 24 18,6X 1.7 kicsapva) 24 15,6X 4,7 A7rpST, liofilizált 24 17,lx 2,4 xSzignifikánsan magas (P,0t) a negatív kontrolihoz viszonyítva egy variációs analízist követő egyoldalú Dunneti teszt alapján. 4. példa A4 rekombináns borjú szomatotropin kicsapása tisztított, liofilizált A4 rekombináns borjú szomatotropinból (A4rbST-ből, rekombináns borjú szomatotropin, amelynek szekvenciája megegyezik a 35 természetes borjú szomatotropin teljes szekvenciájával, azzal az eltéréssel, hogy az első 4 N-terminális aminosav hiányzik; részletesen ismertetik a 103 395. számú közzétett európai szabadalmi beje lentésben) ionmentes vízzel 10 mg/kg kon ceutráció- 40 jú A4rbST oldatot készítettünk. Az anyagot 100 térfogat, az 1. példában meghatározott karbonát pufferrel szemben dializáltuk, és ezen anyag egy részét 9 rész 7,4-es pH-jú karbonát puff errel hígítottuk. A kapott oldathoz azután 1 -A4rbST-t adtunk 45 0,02 |i Curie/ml végkoncentráció eléréséig, hogy a centrifugálás során kapott felülúszó radioaktivitásának mérése alapján a kicsapás százalékát meghatározzuk. Átmeneti fém sójaként cink-, mangánfü)- és 50 réz(II)-kloridot használtunk. Minden sóból 24 mmólos, 2,4 mmólos és 0,24 mmólos oldatot készítettünk. Pozitív kicsapási kontrollként 20%-os triklór-ecetsav-oldatot használtunk. A fémsók vagy a triklór-ecetsav-oldatnak 0,5 ml-ét a A4rbST-t tar- 55 talmazó vizes oldatok 0,5 ml-éhez adtuk, és a kicsapást keverés közben, egy órán át és szobahőmérsékleten végeztük. A kicsapott anyagot 15 000 g-n 10 percig, szobahőmérsékleten való centrifugálással szemcséztük. A dupla csövekben lévő felülúszóból 60 0,5 ml-t kivettünk és polipropilén csövekben számláltuk a beütéseket. A minimális beütésszám a háttérénél négyszer nagyobb volt. A szemcseképződést vizuálisan értékeltük. A kapott eredmények az 1. példa eredményeihez hasonlóak voltak. 65 5. példa A kicsapott A4rbST oldhatósága és bioaktiv! tásr A kicsapási kísérlet előkészületeként 500 mg, 3. példa szerint készült A4rbST-t 50 ml ionmentes vízben (dH20-ban) oldottunk. Az anyagot 7,4-es pH- jú karbonát pufferrel szemben dializáltuk, amíg a dializátum pH-ja 7,6-ra emelkedett. Ezután 3 milliekvivalens sósavval a pH-t 7,4-re állítottuk, és az oldat szobahőmérsékleten, 1500 g-n centrifugálva kitisztult. A semleges A4rbST-oldatból 10 ml-es részleteket vettünk ki, amelyekhez 2,4 mmólos cink-kloridvagy 2,4 mmólos réz(II)-klorid-oldatot adtunk. Egy órás, szobahőmérsékleten való keverés után a szuszpenziót 15 000 g-n 30 percig centrifugálva szemcséztük. Minden szemcsét -80 °C-on megfagyasztottunk és 20 ml, semleges pH-jú A4rbST-oldatbó! ionmentes vízzel 50%-osra való hígítás után kapott, fagyasztott kontroll mintával párhuzamosan liofilizáltunk. A liofilizált minták száraztömegét és százalékos tisztaságát meghatározva következtettünk minden kicsapási eljárásnak a liofilizálásos kezeléshez viszonyított hatékonyságára. A fémsóknak a A4rbST bioaktivitására gyakorolt hatásának meghatározására a 3. példában leírtakhoz hasonlóan növekedési kísérleteket végeztünk olyan patkányokkal, amelyeknek hipofízisét eltávolítottuk. A kísérlethez a vizsgálat megkezdésekor 36 napos olyan nőstény patkányokat használtunk, amelyek hipofízisét eltávolítottuk, és az állatokat tizes csoportokba osztottuk. A csoportosítást tömeg szerint végeztük úgy, hogy az átlagos kiindulási tömeg minden csoportban közel azonos volt Minden patkánycsoporthoz rendeltünk egy keze-6
