203367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropinok kinyerésére híg vizes oldatból
HU 203367B lést. A patkányok minden nap, kilenc napon át szomatotropin vagy kontroll-oldatot kaptak szubkután injektálva. Az injektálás a koponya alá, a lapocka alatti terület közelében történt. A szomatotropin szolubilizálására a következő Parlow puf fer-oldatokat használtuk; I. NaHC03 (0,03 ól),NaCl (0,15mól), apH8 mólos nátrium-hidroxiddal 10,8-re állítva. II. NaHC03 (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 9,5-re állítva. A A4rbST ismert mennyiségét 10,8-es pH-jú pufferben oldottuk, az oldat pH-ját 2 n sósavval 9,5- re állítottuk be és a térfogatot 9,5-es pufferrel a kívánt értékre egészítettük ki. Egy 10-es patkánycsoport szolgált negatív kontrollként, és ezeknek az állatoknak a szomatotropin oldására használt hordozót adtuk injekció formájában. Egy második csoport liof üizált A4rbST oldatot kapott. A további csoportoknak a találmány szerinti, átmeneti fémmel kicsapott A4rbST kiválasztott dózisainak oldatát adtuk injekció formájában. A patkányokat az 1., 2., 9. és 10. napon mértük, és a testtömegeket feljegyeztük. A vizsgálati időszak végén, a 10. napon a patkányok tömeggyarapodására vonatkozó adatokat analizáltuk. 6. példa Természetes borjú szomatotropin kicsapása Tisztított, liofüizált szomatotropint (bST), amelyet hipofízisekből állítottunk elő, annyi ionmentes vízben oldottunk, hogy 10 mg bST/ml koncentrációjú oldatot kaptunk. Az anyagot 100 térfogat, az 1. példában meghatározott karbonát pufferrel szemben dializáltuk, és a dializált anyag egy részét 9 rész 7,4-es pH-jú karbonát pufferrel hígítottuk. Az így kapott ÜST oldatokhoz annyi 125I-bST-t adtunk, hogy a végkoncentráció 0,02 |x Curie/ml lett. így a centrifugáláskor kapott felülúszó radioaktivitásának mérése alapján lehetővé vált a kicsapás százalékának meghatározása. Átmeneti fémek sóiként cink-kloridot, mangán(II)-kloridot és réz(II)-ldoridot használtunk. Minden sóból 24 mmólos, 2,4 mmólos és 0,24 mólos oldatokat készítettünk. Pozitív kicsapó kontrollként 20%-os triklór-ecetsav-oldatot használtunk. A fémsókat vagy a triklór-ecetsav-oldatokat a bST-t tatalmazó vizes oldatokhoz adtuk, és a kicsapást keverés közben, szobahőmérsékleten, egy órán át végeztük. A kicsapott anyagot 15 000 g-n 10 percig, szobahőmérsékleten centrifugálva szemcséztük. A dupla csövekben lévő felülúszóból 0,5 ml-es részleteket vettünk ki, és polipropilén csövekben számláltuk a beütéseket. A minimális beütésszám a háttérének négyszerese volt. A szemcseképződést vizuálisan vizsgáltuk. A kísérleti eredmények az 1. példában kapottakhoz hasonlóak voltak. 7. példa A kicsapott hST oldhatósága és bioaktivitása A kicsapási kísérlethez 500 mg, a 6. példa szerint előállított bST-t 50 ml ionmentes vízzel (dH20-val) elegyítettünk. Az anyagot 7,4-es pH-jú pufferrel szemben extenzíven dializáltuk, és az oldat 1500 g-n szobahőmérsékleten végzett centrifugálás hatására kitisztult. 11 A semleges bST oldatból 10 ml-es részleteket vettünk ki, amelyeket azonos térfogatú 24 mmólos cink-klorid vagy 2,4 mmólos réz(II)-klorid oldattal elegyítettünk. Egy órás szobahőmérsékleten való állás u tán a szuszpenziókat 30 percig, 15 000 g-n centrifugálva szemcséztük. Minden szemcsét -80 °C-on megfagyasztottunk, és 20 ml, semleges pH-jú bST- oldatból ionmentes vízzel 50%-osra való hígítás után kapott, fagyasztott kontroll mintával párhuzamosan liofüizáltunk. A liofüizált minták száraztömegét és százalékos tisztaságát meghatározva következtettünk minden kicsapási eljárásnak a liofiiízálásos kezeléshez viszonyított hatékonyságára. A fémsóknak a bST bioaktivitására gyakorolt hatásának meghatározására a 3. példában leírtakhoz hasonlóan növekedési kísérleteket végeztünk olyan patkányokkal, amelyeknek hpofízisét eltávolítottuk. A kísérlethez a viszgálat megkezdésekor 36 napos olyan nőstény patkányokat használtunk, amelyek hipoízisét eltávolítottuk, és az állatokat tízes csoportokba osztottuk. A csoportosítást tömeg szerint végeztük úgy, hogy az átlagos kiindulási tömeg minden csoportban közel azonos volt. Minden patkánycsoporthoz rendeltünk egy kezelést. Ä patkányok minden nap, kilenc napon át szomatotropin vagy kontroll oldatot kaptak szubkután injektálva. Az injektálás a koponya alá, a lapocka alatti terület közelében történt. A szomatotropin szolubilizálására a következő Parlow puffer-oldatokat használtuk: I. NaHC03 (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 10,8-re állítva. H. NaHC03 (0,03 mól), NaCl (0,15 mól), a pH 8 mólos nátrium-hidroxiddal 9,5-re áUítva. A bST ismert mennyiségét 10,8-esd pH-jú pufferben oldottuk, az oldat pH-ját 2 n sósavval 9,5-re állítottuk be, és a térf ogatot 9,5-es pufferrel a kívánt értékre egészítettük ki. kEgy 10-es patkánycsoport szolgált negatív kontrollként, és ezeknek az állatoknak a szomatotropin oldására használt hordozót adtuk injekció formájában. Egy második csoport liofüizált borjú szomatotropin oldatot kapott. Ä további csoportoknak a találmány szerinti, átmeneti fémmel kicsapott bST kiválasztott dózisainak oldatát adtuk injekció formájában. A patkányokat az 1., 2., 9. és 10. napon mértük, és a testtömegeket feljegyeztük. Avizsgálati időszak végén, a 10. napon a patkányok tömeggyarapodására vonatkozó adatokat analizáltuk. 8. példa Természetes sertés szomatotropin kicsapása Tisztított, liofüizált sertés szomatotropint (pST), amelyet eredetileg hipofízisekből állítottunk elő, annyi ionmentes vízben (dH20-ban) oldottunk, hogy 10 mg pST/rnl koncentrációjú oldatot kaptunk. Az oldatot 100 térfogat, az 1. példában meghatározott karbonát pufferrel szemben dializáltuk, és a dializált anyag egy részét 9 rész 7,4-.es pH-jú karbonát pufferrel ^hígítottuk. Az így kapott pST oldatokhoz annyi 125I-pST-t adtunk, hogy a végkoncentráció 0,02 (j, Curie/ml lett. így a centrifugáláskor kapott felülúszó radioaktivitásának mérése alapján le12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
