203349. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektív az adenozin-receptorokra ható diimidazo- és imidazopirazolo-pirimidinek, és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 203 349 B 2 nM, ugyanakkor az agyszeletvizsgálat A-2 receptorokon mért Ki értéke 49±17 nM. Ezen túlmenően az XAC sokkal hatékonyabban antagonizálja az adenozin-analógoknak a szívfrekvenciára gyakorolt hatását, mint a vérnyomásra gyakorolt hatását. Mivel általánosan ismert, hogy úgy tűnik, az adenozin-analógok által a szívre gyakorolt hatást A-l receptorok közvetítik, és a vérnyomásra gyakorolt hatást az A-2 receptorok közvetítik, az XAC in vivo körülmények közötti szelektivitása arra enged következtetni, hogy az in vitro körülmények között tapasztalható adenozin-receptor-aktivitás összefügg az in vivo körülmények közötti adenozin-receptor-aktivitással, és hogy megkülönböztethetünk specifikus fiziológiai hatásokat ezen szelektivitás eredményeként [lásd B.B. Fredholm, K.A. Jacobsen, B. Jonzon, K.L. Kirk, Y.O. Li és J.W. Daly "Evidence that a Novel 8-Phenyl-Substituted Xanthine Derivative is a Cardioselective Adenosine Receptor Antagonist In Vivo” c. közleményét, Journal of Cardiovascular Pharmacology, 9, 396-400 (1987), K.A. Jacobsen, K.L. Kirk, J.W. Daly, B. Jonzon, Y.O. Li és B.B. Fredholm „Novel 8-Phenyl-Substituted Xanthine Derivative Is Selective Antagonist At Adenosine Receptors In Vivo, Acta Physiol. Scand., 341-42 (1985)]. Szintén ismert, hogy az adenozin jelentős vérnyomás-csökkenést okoz. Ez a vérnyomás-csökkenés valószínűleg egy, az A-2 receptor által közvetített perifériás rezisztanciától függ. Az adenozin-analógok szintén képesek csökkenteni a szívfrekvenciát. Ezt a hatást valószínűleg az A-l altípusú adenozin-receptorok közvetítik. Ennélfogva nyilvánvaló, hogy az itt ismertetett adenozin-receptor szelektív adenozin-analógok farmakológiái adagolása szelektív kötődést eredményez vagy az A-2 vagy az A-l receptorhoz, ami ezzel szemben szelektív módon vagy a vérnyomás csökkenését vagy a szívfrekvencia csökkenését eredményezi, például ezáltal ezen fiziológiai hatásoknak az in vivo szétkapcsolását. Az ilyen adenozin-receptor szelektív szerek kiválasztását az alábbiakban részletezett módszerekkel határozhatjuk meg. Az alábbiakban ismertetett vizsgálatot alkalmazzuk arra, hogy meghatározzuk a vizsgált vegyületeknek a [3H]5’-N-etil-karboxamido-adenozin (NECA) ligandummal való versengési képességét az adenozin A-2 receptorokért, amely receptorokat állati agyi membránokból preparálunk [lásd szintén R.R. Bruns, G.H. Lu és TA. Pugsley „Characterization of the A-2 Adenosine Receptor Labelled by [3H]NECA in Rat Striatal Membranes” c. közleményét* Mol. Pharmacol., 29, 331-346 (1986)]. Fiatal hím patkányokat (C-D törzs), melyeket Charles Rivertől szerzünk be, lefejezéssel megölünk és az agyukat eltávolítjuk. A patkányok agyi sritátumából membránokat izolálunk ligandumkötésre. A szövetet homogenizáljuk 20 térfogatnyi jéghideg 50 mM-os Tris-HCl-pufferben (pH-7,7), polytront alkalmazva (beállítás 6; 20 másodpercre). A homogenizátumot 50 000 xg értéken 10 percig 4 *C-on centrifugáljuk. A pelletet ismét homogenizáljú, polytronban 20 térfogatnyi pufferben, és az előbbiek szerint centrifugáljuk. A pelletet végül ismételten szuszpendáljuk 40 térfogatnyi 50 mM-os Tris-HCl-pufferben (pH-7,7) a szövet eredeti nedves súlyának egy grammjára számítva. Inkubációs csövekbe - három párhuzamost alkalmazva - töltünk 100 pl [3H]NECA-t (94 nM a vizsgálatban), 100 pl 1 pM-os ciklohexil-adenozint (CHA), 100 pl 100 mM-os MgClj-t, 100 pl 1 IV/ml adenozin-deaminázt, 100 pl vizsgálandó vegyületet, amely különböző koncentrációban a 1010—10"4 M tartományban, pufferben van oldva (50 mM-os Tris-HCl, pH-7,7) és 0,2 pl membrán-szuszpenziót (5 mg nedves súly), és 1 ml végtérfogatra töltjük fel 50 mM-os Tris-HCl (pH-7,7) pufferrel. Az inkubációt 25 *C-on végezzük 60 percen át A csövek tartalmát GF/B üvegszálas szűrőn át vákuumban leszűrjük. A leszűrt anyagokat kétszer öblítjük 5 ml jéghideg pufferrel. A szűrőkön lévő membránokat szcintillációs edényekbe visszük át amelyekhez 8 ml Omnifluort - amely 5% Protosolt tartalmaz - adunk. A szűrők radioaktivitását folyadékszcintillációs spektrometriás módszerrel mérjük meg. A [3H]NECA specifikus kötődését a vakpróbákét meghaladó értékként mérjük 100 pM 2-klór-adenozin jelenlétében. Az összes membránhoz kötött aktivitás kb. 2,5%-a annak, mint amit a kémcsövekbe adunk. Mivel ez a feltétel az összes kötést a radioaktivitásnak kisebb, mint 10%-ára korlátozza, a szabad ligandum koncentrációja nem változik észrevehetően a kötés meghatározása folyamán. A membránokhoz való specifikus kötődés az összes kötésnek mintegy 50%-a. A membránszuszpenzió proteintartalmát O.H. Lowry, NJ. Rosebrough, A.L. Farr és RJ. Randall „Protein Measurements With Folin Phenol Reagent” c. J. Bioi. Chem., 193, 265-275 (1951) helyen megjelent közleményében leírt módszere szerint határoztuk meg. Ha egy vizsgálandó vegyület kiszorítja a [3H]NECA kötés 15%-át vagy annál többet, az az adenozin A-2 hely iránti affinitását mutatja. Egy vegyületnek az a moláris koncentrációja, amely a ligandum-kötések 50%-át inhibeálja, az IC» érték. 100-1000 nM tartoamányba eső érték igen hatékony vegyületre utal. Az alábbiakban ismertetett vizsgálatot arra alkalmazzuk, hogy meghatározzuk a vizsgált vegyületnek a [3H]cikloadenozin-ligandummal való versengése képességét az adenozin A-l receptorokért, ameff receptorokat patkány agyi membránokból preparálunk. Hím Sprague-Dawley patkányokat lefejezéssel leölünk, és a teljes állati agyakból izoláljuk a membránokat [lásd R. Goodman, M. Cooper, M. Gavish és S. Synder „Guanine Nucleotide and Cation Regulation of the Binding of [3H] Diethylphenilxanthine to Adenosine A-l Receptors in Brain Membrane” c. közleményét: Molecular Pharmacology, 21, 329-336 (1983)]. A membránokat homogenizáljuk (polytron alkalmazásával, beállítás 7; 10 másodpercre) 25 térfogatnyi jéghideg 50 mM-os Tris-HCl-pufferben, pH-7i7 értéken. A homogenizátumot 19 000 rpm értéken centrifugáljuk 10 percig 4 "C-on. A pelletet mossuk úgy, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
