203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 rációja a 10-20 mg/ml tartományban helyezkedik el. A tisztítást protein-A Sepharose-zal (Pharmacia), vagy urokináz-Sepharose affinitáskromatográfiával végezzük. d) Az anti-urokináz monoklonal is antitestek tisztítása affinitáskromatográfiával, SepharoseR -urokináz oszlopon Sepharose-urokináz konjugátumot állítunk elő oly módon, hogy CNBr-dal aktivált Sepharose-t nagy tisztaságú HMW urokinázzal (120000 IU/mg) reá gáltatunk. A kapcsolási hatásfok kb. 20 mg urokináz/duzzadt gél. Az előbbiek szerint előállított aszcitesz folyadékot (1 ml/termelő hibridóma) ezután felvisszük a Sepharose-urokináz affinitáskromatográfiás oszlopra (1,6 cm x 15 cm), amelyet előzetesen pH 8,0 0,01M nátriumfoszfát pufferrel hoztunk egyensúlyba. Ugyanezzel a pufferrel végzett öblítés után a szelektíven adszorbeálódott anti-urokináz monoklonális antitesteket pH 3,0 0,1M ecetsav pufferrel eluáljuk. Az antitestet tartalmazó frakciókat összeöntjük és PSDE 09005 (Millipore cég által gyártott membránon való ultraszűréssel betöményítjük, majd felhasználásig fagyasztva tároljuk. e) A monoklonális antitestkészítmények tisztaságának és homogenitásának meghatározása gélelektroforézissel Az előbbiek szerint előállított monoklonális antitesteket SDS-PAGE-nek (nátrium-dodecilfoszfátpoliakrüamid gélelektroforézisnek) vetjük alá a W. K. Laemmli által leírt módszer szerint (Nature 227, p. 680, 1970). Csak az IgG nehéz és könnyű láncának megfelelő sávok észlelhetők; ez arra mutat, hogy az előbbiek szerint előállított eluátum tiszta immunglobulinokat tartalmaz. f) Az affinitási állandó meghatározása 20%-os Sepharose-urokináz szuszpenzióból - amelyet pH 7 foszfátpufferes sóoldattal készítettünk el - alikvot mennyiségeket (0,5-0,5 ml-t) adagolunk növekvő koncentrációjú tisztított anti-urokináz monoklonális antitestkészítményekhez (ezeket az előbbi d) pont szerint állítottuk elő és pH 7 foszfátpuff eres sóoldatban dializáltuk). A mintákat 2 órán át szobahőmérsékleten egy keverődobban forgatjuk A kontrollokhoz nem adagoltunk gyantát. A meg nem kötött antitest koncentrációját spektrofotometriásán határozzuk meg 280 nm-en (Ej**-14), míg a megkötött antitest koncentrációját a különbség alapján számítjuk ki a beadagolt antitest teljes mennyiségének ismeretében. Valamennyi, a kötődésre vonatkozó adatot Scatchard szerint dolgozzuk fel (Amm. N. Y. Acad. Sei. 51, p. 660-672,1949). Az 5B4 jelű monoklonális antitest affinitási állandója 1,42 x 1071 jnól-1. 2. példa Az 5B4 anti-urokináz monoklonális antitest rögzítése aktivált agarózon. Aktivált agarózt (Affi-gel 10*, Bio-rad Inc., 14 g, nedves; keresztkötéses agaróz gyöngyök, N-hidroxiszukcinimid aktív észter származék, 10 atomnyi hosszúságú töltésmentes távkarral) 3 térfogatnyi izopropilalkohollal és 3 térfogatnyi hideg desztillált vízzel mosunk 20 percen át. A gélt ezután pH 8 1M nátriumhidrogénkarbonát pufferben szuszpendáljuk (végtérfogat 20 ml). A gélszuszpenzióhoz hozzáadunk az előbbiek szerint előállított nagy tisztaságú 5B4 monoklonális antitesteket pH 8 lMnátriumhidrogénkarbonát pufferben szuszpendálva (9,7 ml). 4 órai állás után, szobahőmérsékleten, 1,5 ml pH 8 1M vizes etanolamin-hidrokloridot adagolunk a gyanta nem reagált észtercsoportjainak megkötésére. A blokkolási reakció szobahőmérsékleten 1 óra alatt lezajlik. A gélt ezután betölt jük egy oszlopba és a következőkkel mossuk; 10 térfogatnyi kapcsoló puffer (0,1M pH 9 vizes nátriumhidrogénkarbonát), 0,1M vizes ecetsav, majd 0,1M vizes ecetsav, amely nátriumkloridra 1M töménységű és végül pH 7 0,05M vizes nátriumfoszfát puffer, amely nátriumkloridra 0,5M. A kapcsolás hatékonyságát spektrofotometriásán értékeljük ki 280 nm-en, a reakció előtt és után mérve a felülúszó optikai sűrűségét. A meghatározás előtt a mintákat pH 2-re állítjuk be annak érdekében, hogy a leolvasás során kiküszöböljük az N-hidroxi-szukcinimid interferenciáját. 1 ml gyantára számítva 2,5-4 mg 5B4 monoklonális antitestet rögzítettünk. 3. példa a) Az 5B4-agaróz immunadszorbens kapacitásának meghatározása Az 5B4 agaróz maximális kapacitását „tiszta" és „nyers” urokinázkészítményekkel határozzuk meg. 5B4 agaróz oszlopot (1,6 X 10 cm) pH 7 0,5M NaCl- 0,05M Na-foszfátpuffer oldattal hozunk egyensúlyba és az oszlopra „tiszta” urokinázt viszünk fel (120000 IU/mg), amíg eszterolitikus aktivitás mutatható ki a kifolyóban. Az oszlopot ezután az egyensúlyozó pufferrel mossuk és az enzimet 1M NaQ-0,lM ecetsav oldattal végzett eluációval deszorbeáljuk. Az oszlop maximális kapacitásának a megkötött frakcióban kinyert teljes aktivitást tekintjük. Az urokináz (120000 IU/mg) esetében az 5B4 agaróz kapacitása 216000 IU/ml. Ugyanezt a kísérletet megismételjük egy nyers urokinázkészítmény (700 IU/mg) felhasználásával. Ekkor 174 000 IU/ml kapacitás értéket kapunk. b) A HMW, LMW urokináz és a 18000 molekulatömegű, proteolízissel előállított urokináz fragmentum immunadszorpciója 5B4 agarózon Tisztított HMW urokinázt (30 mg) 8 órán át inkubálunk 1 ml pH 8 50mM nátriumfiszfát pufferben, amely NaCl-ra, 0,2M töménységű. Kb. 4:4:2 arányban HMW és LMW urokinázt, ill. 18 000 molekula tömegű proteolitikus fragmentumot kapunk. Ezeket a termékeket gélszűréssel különítjük el egy keresztkötéses, ellenőrzött molekulatömegű polidextrán (SephadexRG 100,szuperfinom; 1,5 x 100 cm) alkalmazásával. Az oszlopot előzetesen 5mM nátriumfoszfát pufferrel egyensúlyoztuk ki (pH 4), amely NaQ-ra 0,2M5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
