203257. lajstromszámú szabadalom • Eljárás monoklonális anti-urokináz antitestek előállítására, valamint urokináz tisztítására és vizsgálatára
1 HU 203 257 B 2 os. Az eluálást ugyanazzal az oldattal végezzük. 3 ml/óra áramlási sebességgel. Ezután összeöntjük az egyes termékeket tartalmazó frakciókat. Skaláris mennyiségű (az előbbiekben leírtak szerint előállított), 5B4-agaróz szuszpenziókat, pH 7,5 foszfátpuf - feres sóoldatban, amely 0,l/térfVtérf./% TweenR20-at tartalmaz, adunk hozzá kémcsövekhez, amelyekbe 0,5 ml-t mértünk be 250 pg/ml tötnénységű HMW, LMW urokinázoldatból és 18000 molekula tömegű proteolitikus urokináz fragmentum oldatból (ugyanezzel a puff érrel elkészítve) és a végtérfogatot ugyanezzel a pufférrel 1,5 ml-re állítjuk be. A mintákat 1 órán át szobahőmérsékleten keverődobban forgatjuk, majd 5 percen át 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A meg nem kötött anyagot oly módon határozzuk meg, hogy leolvassuk a felülúszó optikai sűrűségét 280 nm-en, a megkötött anyag mennyiségét a teljes hozzáadott mennyiség ismerete alapján a különbség képviseli. A proteolízist ismert módon, az alábbiak szerint végezzük. A tisztított urokinázt 0,05 M foszfát pufferben (pH 7) feloldjuk és 120 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd felvisszük egy Sephadex G-100 szuperfinom oszlopra. Az eluálást 0,05 M foszfát puffer/0,2 M NaCl-dal végezzük, a kapott három frakciót bekoncentráljuk és NaDod S04/poliakrilamíd elektroforézis gélen (12,5% akrilamid) analizáljuk Az egyes frakciók tartalmazzák az 54000, 33000 és az 18000 dal ton molekulatömegű urokinázt. Ebben a kísérletben a HMW urokináz és a 18000 molekulatömegű proteolitikus fragmentum mennyiségének több, mint 90%-a immunadszorpcióval megkötődik a 5B4 agarózon, míg az LMW urokináz nem adszorbeálódik. 4. példa Az urokináz tisztítása immunaffinitás alapján 5B4 agarózon Kromatográfiás oszlopot (1,6 x 9 cm) megtöltünk a 2. példa szerint előállított 5B4-agaróz immunadszorbenssel és egyensúlyba hozzuk pH 7 0,5M vizes nátriumklorid- 0,05M vizes foszfátpuffer oldattal Ezután egy nyers urokinázkoncentrátumot viszünk fel az oszlopra 60 ml/óra sebességgel. Az egyensúlyozó puff érrel végzett mosás után az urokinázt 1M vizes nátriumklorid-oldattal és 0,1M vizes ecetsavval eluáljuk. Az urokinázt tartalmazó frakciókat összeöntjük, semlegesítjük és fagyasztva szárítjuk. A kinyert urokináz fajlagos aktivitása minden esetben nagyobb volt, mint 130000 IU/mg. A kvantitatív adatokat a n. táblázatban mutatjuk be. II. táblázat Frakció Térf. ml Összes fibrinolitikusakt.a) Összes észterolitikusakt.b) Összes fehérje, mg Faji. akt. IU/mg Tisztítási faktor IU/EU IU % EU Nyers kivonat 186 1772394 100 897 2007 883-Meg nem kötött frakció (A) 270 141791 8 164--846 Megkötött frakció (B) 56 1374240 77,5 683 9,52 144353 163 2012 a) lenyegeben a British Pharmacopoea 1979. évi Addenduma módszere szerint vegezve meghatarozast b) lényegében Sherry et al. (J. Láb. Óin. Med 64, p. 145,1964) módszere szerint végezve a meghatározást Hl. táblázat Tromboplasztinszerű szennyezések; nulla koaguláció ®0 193 IU/ml plazma mellett (a National Heart and Lung Institute, AEÁ szerinti nulla koagulációs érték 80 IU/ml plazma) Akut toxicitás egérben: nem toxikus 100000 IU/kg iv. mellett 55 Szisztémás elviselhetőség kutyában; 20000 IU/kg mellett nincs jelentős változás az artériás vérnyomásban 60 A HPLC elemzése a nagy molekulatömegű (54 000) urokináz jelenlétére és a kis molekulatömegű (33 000) urokináz távollétére mutat. A kapott urokináz tisztaságát nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamidon végzett gélelektroforézissel is ellenőriztük. Ez a vizsgálat ténylegesen ugyancsak azt erősíti meg, hogy az 5B4-agarózon tisztított urokináz termék lényegében az 54000 molekulatömegű urokináz. A kísérleteket többször (több mint 50 ciklus) megismételtük anélkül, hogy az eredményekben bármilyen jelentős változás következett volna be. A megkötött frakciókban állandó jelleggel az osz9
