203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 szerkesztéssel egy olyan plazmidot (pJC344) kapunk, amely tartalmazza a hibrid interferon kódoló szakaszát a ß-laktamäz promoter szabályozása mellett. Hasonló módon állítjuk elő a hibrid interferont kódoló gént, amikor is a pAM21 plazmid nagy PvuII-Pstl fragmentumát, a pAM2 plazmid kis Sau3A-PvuII fragmentumát és a pAM21 plazmid kis Sau3A-PstI fragmentumát kapcsoljuk össze. Ez a szerkezet egy olyan plazmidot (pJC342) eredményez, amely a „B1B2D3B4” hibrid interferon kódoló régióját tartalmazza a ß-laktamäz promoter szabályozása alatt. A „B1D2D3D4” hibrid interferont kódoló gént úgy állíthatjuk elő, hogy a pAM21 plazmid kis HidIII-Sau3A fragmentumát, a pAM21 plazmid kis Sau3A-PvuII fragmentumát és a pAM2 plazmid nagy PvuII-HindIII fragmentumát kapcsoljuk össze. Ez a szerkezet egy olyan plazmidot (pAM94) eredményez, amely a ,3iD2D3D4” hibrid interferon kódoló szakaszt tartalmazza a ß-laktamiz promoter szabályozása alatt. Ezzel analóg módon, úgy jutunk a ,3iD2B3B4” hibrid interferont kódoló génhez, hogy összekapcsoljuk a pAM21 plazmid kis HindIII-Sau3A fragmentumát, a pAM2 plazmid kis Sau3A-PvuII fragmentumát és a pAM21 plazmid nagy PvuH-Hindffl fragmentumát. Ez a szerkesztés eredményezi a pAM90 plazmidot, amely a ,31D2B3B4” hibrid interferont kódoló régióját tartalmazza a ß-laktamiz promoter szabályozása alatt. Hasonló módon állíthatjuk elő a ,3iD2B3D4” hibrid interferont kódoló szakaszt (pDMl plazmid) vagy a ,3iD2D3B4” hibrid interferont kódoló szakaszt (pDM2 plazmid) tartalmazó plazmidokat. Ezek a plazmidok alkalmasak arra, hogy E. coliban replikálódjanak és kifejezzék benne a hibrid IFN géneket. Ha a kívánt, bármelyik említett hibrid interferon kódoló DNS-inszertumot ki lehet hasítani a megfelelő plazmidból és be lehet juttatni egy másik vektor DNS-be. Ilyen módon olyan plazmidokhoz juthatunk, amelyek tartalmazzák a hibrid interferont kódoló szakaszát, de más promoter - nem a ß-laktamäz promoter - szabályozása alatt és/vagy lehetővé teszik a gén kifejeződését az E. coli helyett más gazdasejtben. A szóban forgó hibrid interferonok strukturális génjét magába foglaló DNS-t kémiai eljárással, szintetikus úton is előállíthatjuk. A DNS-szintézisére alkalmas módszereket S. A. Narang [Tetrahedron, 39, 3, (1983)] foglalta össze. Az ismert szintetizáló módszerek mintegy 20 bázis hosszúságú polinukleotidok előállítását teszik lehetővé jó kitermeléssel, nagy tisztasággal és viszonylag rövid idő alatt. A megfelelően védett nukleotidokat foszfodiészter módszerrel [K. L. Agarwal és munkatársai, Angew. Chem. 84, 489 (1972)] lehet egymással összekapcsolni vagy a még ha - tékonyabb foszfotriészter módszerrel [C. B. Reese, Tetrahedron, 34, 3143 (1972)] vagy a foszfittriészter módszerrel [R, L. Letsinger és munkatársai, J. Am. Chem. Soc., 98, 3655 (1976)]. Az oligonukleotidok és polinukleotidok szintézisének egyszerűsítését tette lehetővé a szilárd fázisos módszer, amelyben a nukleotid lánc egy megfelelő polimerhez van kötve. Itakura és munkatársai [J. A. Chem. Soc., 103,706 (1981)] foszfodiészter módszerrel, szilárd fázisos szintetizálást használva, trinukleotidokat kapcsoltak össze, ezek rövid időn belül és jó kitermeléssel kondenzálhatok. Ilyen módon például 31 bázisból álló polinukleotidot tudtak előállítani. A kívánt kétszálú DNS-t enzimatikus úton is fel lehet építeni, kémiailag előállított rövid szegmentumokból. Erre a célra Kohrana és munkatársai [J. Bioi. Chem., 251,565 (1976)] mindkét DNS-fonalból álló átfedő polinukleotid szekvenciákat használnak, amelyek a bázispárok révén a helyes helyzetben kerülnek össze és amelyek ezután kémiailag köthetők egymáshoz DNS-ligáz enzimmel. Egy másik lehetőség szerint minden esetben a két DNS-fonalból származó, rövid átfedő szegmentummal rendelkező egy polinukleotid szekvenciát inkubálunk a négy szükséges dezoxinukleozid-trifoszfát jelenlétében DNS- polimerázzal, Uyen például a DNS-polimeráz I Klenow fragmentje, vagy a T4 DNS-polimeráz, vagy az AMV (avian Myeloblastosis virus) reverz transzkriptázzal. A két polinukleotid szekvencia bázispárosodással a helyes elrendezésben kerül össze és a még szükséges nukleotidok az enzim segítségével pótlódnak, miáltal komplett kétszálú DNS keletkezik. [S. A. Narang és munkatársai, Anal. Biochem., 121,356 (1982)]. Itakura és munkatársai [J. Bioi. Chem., 257, 9226 (1982)] leírják, hogy ennek az elvnek az alapján a humán leukocita interferon a2 gén 132 bázispár hosszúságú , szegmentumát fel lehet építeni DNS-polimeráz I (Klenow fragment) jelenlétében 4 kémiai úton szintetizált 39-42 bázis hosszúságú fragmentumból. A kémiai szintézissel 40%-os megtakarítás érhető el, összehasonlítva azzal a módszerrel, amely csak ligázt használ. A jelen találmány szerinti DNS-ek előállítására megfelelő eljárást ír le például a 146785 számú európai szabadalmi bejelentés, amelynek tanulságai itt tájékoztatásként szerepelnek. A találmány szerinti bármelyik hibrid interferon strukturális génjét tartalmazó kémiaüag szintetizált DNS-t be lehet építeni egy olyan vektor DNS-be, amely expressziószabályozó szekvenciát tartalmaz, mégpedig úgy, hogy az expressziószabályozó szekvencia irányítsa a szóban forgó gén kifejeződését. 2. A gazdasejtek transzformálása A transzformált gazdasejt előállítási eljárása magában foglalja a gazdasejt transzformálását egy olyan DNS-szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral, amely a találmány szerint előállított hibrid interferonok egyikét kódolja, és amelyet expressziószabályozó szekyencia irányít. Alkalmas gazdák a fent példaként említett mikroorganizmusok, mint a Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtflis és Escherichia coli A transzformálás a találmány szerinti kifejező vektorokkal történik, például ahogy a szakirodalom leírja a S.cerevisiae [A. Hinnen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. Usa, 75, 1929 (1978)], B. Subtilis [Anagnostopoulos és munkatársai, I. Bacteriel., 81 741 (1961)] és E. coli [M. Mandel és munkatársai, J. Mól. BioL, 53,159 (1970)] eseteire. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
