203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 Eszerint az E. coli sejtek transzformálási eljárása magába foglalja a sejt Ca -mai való előkezelését, hogy végbemenjen a DNS felvétele és a hibrid vektorral való inkubálást. A sejteket ezután át kell vinni szelektív táptalajra, mely a transzformált sejteket az eredeti sejtektől elkülöníti. Azok a sejtek, amelyek nem tartalmaznak vektort, üyen táptalajban elpusztulnak. Az élesztő transzformálása például a következő lépésekből áll: (1) az élesztő sejtfal enzimatikus eltávolítása glükozidáz segítségével, (2) a kapott szferoplaszt kezelése a vektorral polietüén-glikol és Ca2+-ionok jelenlétében, (3) a sejtfal regenerálása oly módon, hogy a szferoplasztot agarba ágyazzuk be. Előnyös, ha a regeneráló agar úgy készül, hogy egyszerre történjék meg a regenerálódás és a transzformált sejtek szelekciója. 3. A transzformált gazdasejtek tenyésztése és a kifejeződött hibrid interferon izolálása A találmány tárgya eljárás az (I)—(VI) szekvenciájú hibrid interferonok előállítására. A módszert az jellemzi, hogy a szóban forgó hibrid interferonok bármelyikét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó hibrid vektorral transzformált gazdasejteket tenyésztjük és a hibrid interferont izoláljuk A transzformált sejteket a szakmában ismert módszerekkel tenyésztjük olyan folyékony táptalajban, amely asszimilálható szén- és nitrogénforrást és anorgikussókat tartalmaz. A találmány szerinti transzformált gazdasejtek tenyésztésére különböző szénforrások használhatók. Előnyös szénforrások például a szénhidrátok, üyen a glükóz, mannit vagy laktóz, vagy acetát, amelyet magában vagy megfelelő keverékben lehet felhasználni. Megfelelő nitrogénforrás például az aminosavak - mint a kazein aminosavai - a peptidek és proteinek, ezek bomlástermékei, mint a tripton, pepton vagy a húskivonatok; továbbá az élesztőkivonat, malátakivonat és az ammónium-sók is, például az ammóniumklorid, -szulfát vagy -nitrát, amelyeket önmagukban vagy megfelelő keverékekben lehet felhasználni. Felhasználható anorganikus sók még például a nátrium, kálium, magnézium és kalcium szulfátjai, kloridjai, foszfátjai és karbonátjai. A táptalaj tartalmaz még például növekedést serkentő anyagokat, üyenek a nyomelemek, például vas, cink, mangán és hasonlók és olyan előnyös anyagokat, amelyek elősegítik a szelekciót és megakadályozzák azoknak a sejteknek a növekedését, amelyekben nincs expressziós plazmid. így például ampicillint adunk a táptalajhoz, ha az expressziós plazmid ampR gént tartalmaz. Az üyen antibiotikus anyagoknak még olyan hatásuk is van, hogy elpusztítják a szennyező, antibiotikum-érzékeny mikroorganizmusokat is. Ha gazdamikroorganizmusként olyan élesztőtörzset használunk, amely például egy esszenciális aminosavra nézve auxotróf, akkor előnyös, ha a plazmid egy olyan enzimet kódoló gént tartalmaz, ami a gazdasejt hibáját kiigazítja. Az élesztőtörzset olyan minimál táptalajon tenyésztjük, amely az Ulető aminosavat nem tartalmazza. A tenyésztés a szakterületen ismert módszerekkel történik. A tenyésztési körülményeket, mint a hőmérsékletet, a táptalaj pH-ját és a fermentálás idejét úgy választjuk meg, hogy magas titerű hibrid interferont kapjunk. Tehát előnyös, ha egy E. coli vagy élesztőtörzset aerob viszonyok mellett, merülő tenyészetben rázással, vagy keveréssel, 20-40 °C hőmérsékleten - előnyösen körülbelül 30 °C-on - pH 4-8 között - előnyösen körülbelül pH=7 mellett - 4-30 órán át, de előnyösen addig tenyésztünk, amíg el nem érjük a hibrid interferon maximális kitermelését. Meglepő módon azt találtuk, hogy például a standard feltételek mellett tenyésztett transzformált élesztő nyers extraktumában a találmány szerinti hibrid interferonok - például a „B[D2D3B4”, „B!D2B3D4 , ,,B| D2D3D4 , „B^D2B3B4 hibrid interferon - elérhető maximális titerei határozottan magasabbak, mint az interferon-a2 és ,3iB2D3D4” és ,JD1D2B3B4”hibrid interferonok titerei, amelyek szoros rokonságban vannak a 4414150 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban szereplő „BD” és ,JDB” hibrid interferonokkal. Ha a sejtsűrűség megfelelő értéket ér el, a tenyésztést megszakítjuk és a hibrid interferont felszabadítjuk a gazdasejtből. Ezért a sejteket elroncsoljuk, például detergens kezeléssel - üyen detergensek az SDS (nátrium-dodecü-szulfát) vagy Triton - vagy lizozimmel vagy egy hasonlóan ható enzimmel lizáljuk. Ha élesztőt használunk a gazda-mikroorganizmusként, a sejtfalat valamely glükozidáz enzimmel való emésztéssel távolíthatjuk el. A sejtek elroncsolását más módon is, vagy kiegészítésül, mechanikai erőkkel is végezhetjük, üyenek a nyíróerők (például X-press, French-press, Dyno malom); vagy a sejteket üvegygyönggyei vagy alumínium -oxiddal rázzuk együtt; vagy váltogatjuk a fagyasztást (például folyékony nitrogénben) a felolvasztással, például 30-40 °C-ig; vagy ezenkívül még ultrahangot is használhatunk. A centrifugálás után - magától értetődő módon - a kapott keverékben, mely proteineket, nukleinsavakat és más sejtalkotórészeket tartalmaz, feldúsítjuk a proteineket a bennük lévő interferonnal együtt. így például a nem protein jeüegű alkotórészeket polietüén-imin kezeléssel eltávolítjuk és a proteineket, beleértve a hibrid interferonokat is, kicsapjuk, például úgy, hogy az oldatot ammónium-szulfáttal vagy más sókkal telítjük. A bakteriális proteineket például 0,1%-os ecetsavval (pH= 4-5) való savanyítással is ki lehet csapni. A további tisztítási lépések közt vannak például a következők: ultraszűrés, diafütrálás, gél-elektroforézis, kromatográfiás eljárások, mint például az ioncserélő kromatográfia, a méret szerinti kizárásos kromatográfia, a HPLC, a reverz fázisos HPLC és ehhez hasonlók, az elegy alkotórészeinek elválasztása molekulanagyság szerint, megfelelő Sephadex-oszlop segítségével, dialízis, affinitáskromatográfia, például antitest - különböző monoklonális antitest - affinitáskromatográfia és más olyan ismert eljárások, amelyek a szakterületen ismertek. Meglepő, hogy a találmány szerinti eljárással előál-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
