203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 Élesztőkivonat (Difco) 10,0 g L-aszparagin.H20 6,6 g KH2P04 1,0 g MgS04.7H20 1,9 g L-hisztidin 0,02 g D-glükóz (monohidrát) 33,0 g ad 1 liter ionmentes víz. Az 500 mi-es lombikban egyetlen terelőlap van és 100 ml táptalajt tartalmaz. A táptalajt ionmentes vízzel készítjük, pH-ja körülbelül 6,0. A glükózt külön sterilizáljuk. Beoltás után az első előtenyészetet 24 órán át 30 °C-on inkubáljuk orbitális rázógépben (5 cm-es lökettávolság), 250 ford/perc sebességgel. Az első lombik előtenyészete szolgáltatja az oltónyagot a második előtenyésztő lombikok számára. Ezek a lombikok 1% (térf/térf) inokulumot kapnak A táptalaj és a tenyésztési feltételek azonosak az első előtenyészetével. A második előtenyésztő fázisból annyi lombik tartalmát egyesítjük, hogy elég legyen 1 %-nyi (térf/térf) inkulumhoz a 30 literes fermentor részére (fermentoronként három lombik). A termelő fermentor hasznos térfogata 30 liter, négy terelőlapáttal és egyetlen hatlapátos tárcsás turbina keverővei - átmérője 115 mm - van ellátva. Keverési sebessége: 400 ford/perc; levegőztetés: 1 térf/térf/perc; túlnyomás: 0,3 bar. A fermentálás hőmérséklete 30 °C. A fermentort az IFN23 táptalajjal együtt sterilizáljuk A táptalaj összetétele: Élesztőkivonat (Difco) 2,0 g L-aszparaginJí20 6,6 g MgS04.7H20 1,0 g L-hisztidin 0,02 g D-glükóz (monohidrát) 33,0 g ad 1 liter ionmentes víz. A glükózt külön sterilizáljuk és úgy adagoljuk, hogy 30 liter legyen a végső térfogat. Beoltás után a fermentlé pH-ját ellenőrizzük és hogy ne essen a pH=6,0 alá, nátrium-hidroxid adagolást végzünk. A fermentáció időtartama körülbelül 18 óra, illetve addig tart, amíg el nem érjük a maximális interferonkihozatalt. Az optikai sűrűség, amely kényelmes mértéke az élesztő növekedésének, a 6-7 OD értéket éri el. A glükóz nagymértékben fogy, de nem fogy el teljesen. A savanyú foszfatáz indukálódik, s ezzel együttjár az interferon termelődése. Az interferon titer meghatározható a nyers extrák - tumokból, amelyet a laboratóriumban, mechanikai sejtfeltárással készíthetünk el. A nyers kivonat literenként 7-109 egységet és megközelítőleg 1 mg/ml proteint tartalmaz. A fermentáció befejeztével a fermentlevet - amennyiben ez szükséges - 10 °C-ra hűtjük le a lefejtés és a hibrid interferon kinyerése előtt. A 30 liter tenyészlevet - pH-ja 6,0-10 °C-ra hűtjük és a sejteket Sharples-centrigugában szeparáljuk. A tiszta felülúszóban nincs IFN-aktivitás. A kapott sejtmassza térfogatát X-pufferrel [mM Tris (pH=8,0), 5 mM EDTA, 0,5 mM NaCl, 20 mM PMSF] 1400 mire és pH=8,0-ra állítjuk be. A szuszpenziót 5-10 °C-ra hűtjük és egy DYNO-malomban (KDL Pilot típus; 0,6 liter) tárjuk fel a sejteket. A malom poliuretán keverőtárcsákkal és 500 ml üveggyönggyel (0,5-0,75 mm átm.) van ellátva, keverési sebessége 3000 ford/perc, az adagolás sebessége: 10 liter/óra. A szuszpenzió pH- ja 8. A feltárt sejteket tartalmazó szuszpenziót centrifugálással derítjük 4 °C-on, Sorvall 6SA rotorban, 12000 ford/perc mellett, 20 percig. A pJDB207 PH05/EFN AMI 19, AM106, AMI 12, DM1, illetve DM2 plazmidot hordozó S.ceievisiae GRF18 törzset ugyanígy tenyésztjük és a megfelelő hibrid interferont tartalmazó derített oldatot ugyanígy állíthatjuk elő. 15. példa Az E. coli HB101/pAM94 törzs kivonatának előállítása és az IFN-aktivitás meghatározása E. coli HB 10 l/pAM94 törzset tenyésztünk, amíg a tenyészet sűrűsége - 650 nm-en mérve - el nem éri a 8-as értéket A tenyésztést 1 liter M9 táptalajban végezzük, amely 0,4% kazein eredetű aminosavakat és 2% glükózt tartalmaz. A sejteket ülepítjük és pufferben reszuszpendáljuk (16 g sejt 160 ml pufferben). A puffer összetétele: 0,1 j± triszHCl (pH=8,0), 0,5 M NaCl, 5 mM EDTA és 100 pmól PMSF. Ezután lizozimet adunk a szuszpenzióhoz 1 mgúnl végső koncén trációig. A szuszpenziót ezu tán 30 percen át jegeljük. A sejtek feltárását Sorvall Omnimix készülékekben végezzük háromszor 60 másodperces beállítással. A feltárt sejteket tartalmazó szuszpenziót centrifugálással derítjük 4 °C-on 20 percig Sorvall 6SA rotorban, 12000 ford/perc mellett. A felülúszó IFN-aktivitását S. Rubinstein és munkatársai nódszerével (lásd fent) határozzuk meg. Azt találtuk, hogy az IFN-aktivitás 5-107 egység/ml sej tkivonat volt. Azonos módon tenyésztettük E. coli HB101/pAM90, pJC334 és pJC342 törzset és az interferon litereket - mint fent - meghatároztuk. A kapott eredmények: 5-108,5-107 és 5-106 egység/ml sejtkivonat. 16. példa Hibridoma sejtek előállítása a) Az immunogén eredete: Egy részlegesen tisztított természetes humán leukocita IFN (IFNa) mintát, melynek specifikus aktivitása 13-106 NE/mg protein, használtunk az immunizálásokhoz. (Beszerezhető az Institut Pesteur-ből, I.-424 számon, a Mikroorganizmus-tenyészetek Nemzeti Gyűjteményéből). b) Immunizálási eljárás: Hét 10-14 hetes*Balb/c nőstény egeret (Sisseln állat-farm, Svájc) immunizáltunk úgy, hogy komplett Freund adjuvánsban (Difco) emulgeált 4-105 NE IFNa-t (16.a) példa) oltottunk az egerek mind a négy talpába. A 30. napon további 4-105 NE IFNa - inkomplett Freund-adjuvánsban - injekciót adtunk, majd a 60. napon amlékeztető oltást (ip.), s az injekció 6-105 NE EFNa-t tartalmazott PBS-ben. Három nap múlva kivettük a lépeket a fúzióhoz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 20
