203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 c) Sejtfúzió: Minden fúziós kísérletet G. Köhler és C. Milstein [Nature, 256, 495 (1975)] eljárása szerint végzünk, a nem-szekretáló Sp 2/0-Agl4 myeloma sejtvonalat [M. Shulman, C. D. Wflde és G. Köhler, Nature 276,269 (1978)] használva. 108lépsejtet 107 myeloma sejttel keverünk össze 1 ml 50%-os polieUlén-glikol (PEG 1500, Serva) jelenlétében. Mosás után a sejteket 48 ml standard Dulbecco-féle minimum esszentiál tápoldatban (Gibco, No. 0422501) reszuszpendáljuk. Fúziónként 3-106 normál egér peritoneális exszudátum sejtet adunk kísérő sejtek gyanánt a szuszpenzióhoz. A sejteket 48 x 1 ml Costar-tartályokba osztjuk el és hetenként háromszor standard HAT szelekciós tápoldattal látjuk el őket, 3-6 héten át Amikor a hibridoma sejtek növekedése láthatóvá válik, a felülúszókat kombinált immunprecipitációs-bioassay segítségével szűrjük(19.példa).Összesen221 hibridomából lOhibridomát találtunk, amelyek anti-IFN a-an ti testet termeltek. A hibridoma sejteket határhígításos módszerrel klónozzuk mikrotitráló lemezeken, legalább egyszer. A 144 BS hibridomát választottuk a további vizsgálatokhoz, mivel ez különösen stabilnak bizonyult és jelentős mennyiség immunglobulint szekretált. 17. példa A monoklonális antitest izolálása és tisztítása 8-10 hetes BaltVc egereket (Sisseln állatfarm, Svájc) ip. adott Pristane-nal (Aldrich) előkezelünk, majd 2-3 héttel később 2-5-106 klónozott hibridoma sejttel és 0,2 ml Pristane-nal oltjuk be őket ip., 8-10 nap múlva aszcitesz folyadékot gyűjtünk, melyet lecentrifugálunk 800 g mellett és ezután -20 °C-on tároljuk. A felolvasztott aszcitesz folyadékot 50000 g mellett 60 percig centrifugáljuk, a felületén úszó zsírréteget óvatosan eltávolítjuk és a proteinkoncentrációt 10-12 mg/ml-ra állítjuk be. A nyers immunglobulin kicsapását úgy végezzük, hogy cseppenként 0,9 térfogatnyi telített ammónium-szulfátot adunk hozzá 0 °C- on, majd a csapadékot 20 mM trisz.HCl/50 mM NaCl (pH=7,9) tartalmú puff erben oldjuk és ugyanezen puf - ferrel szemben dializáljuk. DEAE-D52 cellulóz (Whatman) kromatográfiájával - 20 mM trisz. HC1/25-400 ipM NaCl (pH=7,9) puffer gradiens rendszert alkalmazva - választjuk el az immunglobulin frakciót. Az immunglobulint újra kicsapjuk ammónium-szulfáttal és a csapadékot PBS-ben oldjuk úgy, hogy a koncentráció 10 mg/ml legyen. áDS-PAGE vizsgálat szerint a 144 BS monoklonális antitest tisztasági foka nagyobb, mint 95%. 18. példa Monoklonális antitestek osztály- és alosztály- meghatározása A klónozott hibridoma sejtek által termelt monoklonális antitestek osztályát és alosztályát az ismert Ouchterlony-féle agargél immundiffúziós technikával határozzuk meg, osztály- és alosztály-specifikus nyúl antitestek (Bionetics) felhasználásával. Az eredményeket enzim-immunassay-vel (ELISA) ellenőrizzük a következőképpen: mikrotitráló lemezeket fedünk osztály vagy alosztály-specifikus, nyúlszérumból előállított, immunglobulinnal: tartályonként 50 pj PBS- ben 1 pg-al (Bionetics). A lemez szabad kötő-kapacitását 1% BSA és 0,2% NaNj (súly/térf.) tartalmú PBS-sel (pH=7,4) telítjük. A tartályokban monoklonális antitestet tartalmazó 100 pl-nyi mintákat inkubálunk 37 °C-on 1 órán át. A lemezeket PBS-el mossuk, azután 37 °C-on inkubáljuk 1 órán át olyan foszfatázzal konjugált nyúl immunglobulin készítménnyel, amelynek specificitása azonos azzal az immunglobulinéval, amellyel a lemezeket fedtük. A megkötött enzimet 37 °C-on 30 percig tartó inkubálással hívjuk elő az enzim szubsztrátumának - pnitrofenfl-foszfát -oldatával [1 mg/ml 10%-osdietanolamin pufferben, amely 0,5 mM MgCl2-t és 0,02% tömeg/térf.) NaN3-et tartalmaz; pH=9,8] és az optikai sűrűséget 405 nm-en mérjük. A144 BS monoklonális antitestek az IgG j k (kappa) osztályba tartoznak. 19. példa Kombinált immunprecipitációs bioassay 50 gl nyers, természetes humán leukocita IFN-t vagy rekombináns IFN a polipeptidet (20a) példa) (104 NE/ml) azonos mennyiségű vizsgálandó anyaggal keverünk, például a hibridomák tenyészetének felülúszóival, vagy a tisztított monoklonális antitestek PBS-oldataival és mikrocsövekben (Eppendorf 3810) inkubáljuk a keveréket 37 °C-on 1 órán át. Ezután 50 pl előzőleg betitrált nyúl-anti-egér lg antitestet (Nordic) adunk a keverékhez, melyet ezután 37 °C-on 2 órán át és 4 °C-on 16 órán át inkubálunk, miközben a szabad és az ŰN-hez kötött monoklonális antitestek immunkomplexeket alkotnak. A csöveket 4 °C-on 5 percig centrifugáljuk 12000 ford/perc mellett. Az immun-precipitátumot egyszer mossuk 1 ml hideg pufferolt konyhasóoldattal (pH=7,2), majd 200 pl puff erőit, pH=2,2-es konyhasóoldatban oldjuk. Az ekkor felszabaduló IFN-aktivitást a J. A Armstrong-féle [Appl. Microbiol., 21, 723 (1971)] standard bioassay segítségével határozzuk meg. A Mengo-vírus citopátiás gátlását (400 plakk-képző egység/tartály) Hep 2 sej - tek (3-104 sejt/tartály) használatával határozzuk meg, mikrotitráló lemezeken. 20. példa Interferon speciftcitás meghatározása a) A rekombináns IFa polipepiid eredete: A LyIFN-a-1, LyIFN-a-2 és LyEFN-a-3 polipeptideket, amelyek rokonságban vannak az IFNaF, IFNodB, Uletve IFNaD-vel, a 197047 számú magyar szabadalmi leírás (szabadalmas: CIBA-GEIGY) írja le. Az IFNaA-t a Hoffmann-La Roche cég hozza forgalomba (Roferon A). Az IFNaC és oJ a 43980 számú európai szabadalmi bejelentés szerint állítható elő. b) Az összehasonlításra használt IFN elleni monoklonális antitestek eredete: Az 1K2 és 2K2 monoklonális antitesteket a 210S510 számú brit szabadalmi leírás alapján állítottuk elő. Az NK2 és YOK monoklonális antitestet (Mab-t) a Celltechtől (Berkshire), az IY-1 és IY-2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 21
