203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 A pJDB207R/IF(a-2)A72 plazmidot (100561 számú európai szabadalmi bejelentés) BamHI-gyel és PvuH-vel emésztjük és egy 6,8 Kb nagyságú DNS- fragmentumot izolálunk Hasonlóan, a pJDB207R/IF(a-3) plazmidot (100561 számú európai szabadalmi bejelentés) is ugyanezen enzimekkel emésztjük és a 800 bp hosszú fragmentumot izoláljuk. A két DNS-fragmentumot összekapcsoljuk ligá/zal, s az E. coli HB101 ampicülin rezisztens, transzformált sejtjeiben lévő pJDB207 PH05/IFN HRÍ43 plazmid a „D1D2B3B4” hibrid interferont kódoló szakaszt tartalmazza. A kapott klón elnevezése a következő: S.cerevisiae GRF18 pJDB207 PH05/IFN HRÍ43. 12. példa A Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformálása és az interferontermelés indukálása A pJDB207 PH05/IFN AM129 (,31D2D3D4”) plazmidot bevisszük a GRF18 S.cerevisiae törzsbe (a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, canR) oly módon, ahogyan ezt Hinnen és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929 (1978)]. Egy |xg plazmid DNS-t adunk 100 pl szferoplaszt szuszpenzióhoz és a keveréket polietüén-glikollal kezeljük. A szferoplasztokat 10 ml regeneráló agarral keverjük el, majd leucint nem tartalmazó élesztő-minimál-táptalajt tartalmazó lemezre visszük a sejteket. Három nap 30 °C- on való inkubáció után mintegy 1000 transzformált sejtet kapunk. Az élesztő transzformáló lemezekről egyetlen élesztő telepet (neve: Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB PH05/IFN AM129) emelünk ki és 10 ml élesztőminimál-táptalajt tartalmazó 100 ml-es Erlenmeyer lombikba visszük, majd 30 °C-on, 200 ford/perc mellett 24 órán át tenyésztjük, kürülbelül 2-3-107 sejt/ml sűrűségig. A sejteket egyszer mossuk 20 ml alacsony Pjétrékűminimál tápoldattal [Difco-féle élesztőminimál-táptalaj, aminosavak nélkül, amelyet 20 g/1 glükózzal egészítünk ki; a tápoldatot a komponensekből mi készítjük el a Difco receptje szerint (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA), kivéve, hogy 0,03 g/1 KH2P04-et és 1 g/1 KCl-t használunk 1 g/1 KH2P04 helyett]. A reszuszpendált sejtekből 3 ml-rel oltunk be 300 ml alacsony-Pj értékű minimál tápoldatot és 300 ml normál minimál táptalajt tartalmazó 1000 ml-es Erlenmeyer-lombikokat. A sejteket 30 °C- on 160 ford/perc mellett inkubáljuk. A PH05 promoter indukálódást úgy követjük, hogy mérjük a savanyú foszfatáz aktivitás megjelenését a teljes tenyészetben [Toh-e és munkatársai, J. Bacteriol, 113,727 (1973)]. A sejteket 1-2-107 sejt/ml sűrűségig tenyésztjük (26-30 óra inkubálás). 13 13. példa Élesztösejt-fávonatok készítése és az interferon titer meghatározása A sejteket 300 ml 1-2-107 sejt/ml sűrűségű táptalajból (12. példa) gyűjtünk össze centrifugálással, Sorvall GSA rotorban, 5 percen át 8000 ford/perc mellett, 4°C-on. A sejteket egyszer mossuk 100 ml vízzel. majd 6 ml jéghideg lizáló keverékben [0,1 M káliumfoszfát puffer (pH 7,4), 1% (térf/térf) Triton X-100, 0,0001 mól PMSF (Merck)] reszuszpendáljuk (PMSF-fenil-metü-szulfonil-fluorid) és átvisszük egy 30 ml-es Corex-csőbe. A szuszpenziót újra centrifugáljuk 5 percig Sorvell SS-34 rotorban 8000 ford/perc mellett, 4 °C-on és az üledéket 3 ml lizáló keverékben reszuszpendáljuk 0 °C-on. A sejtekhez 4 g üveggyöngyöt (0,4 mm átm.) adunk, s a szuszpenziót Vortex-keverőben (Scientific Instruments, Inc., USA) rázzuk 30 másodpercig teljes sebességgel, majd 1 percig jégfürdőben hűtjük. Ezt a rázásos eljárást 5-10-szer ismételjük, amíg a sejtek több mint 90%-a feltáródik (fénymikroszkóp alatt ellenőrizzük). A sejttörmelékeket és az üveggyöngyöket centrifugálással - 10 perc, 8000 ford/perc, 4 °C, Sorvall HB-4 rotor - távolítjuk el az oldatból. A felülúszót Eppendorf-csövekbe töltjük át, folyékony nitrogénben fagyasztjuk és -60 °C-on tároljuk. Az interferonaktivitását S. Rubinstein és amunkatársai szerint [J. Virol., 37, 755 (1981)] mérjük. Az eredmény 7-109 egység/ml sejtkivonat volt. A 12. és 13. példában leírtakkal analóg módon transzformáljuk a S.cerevisiae GRF18 törzset az alábbi plazmidokkal: pJDB207 PH05/IFN AMI 19 (,31D2B3B4”), AM106 (,3iB2B3D4”), AMI 12 (.31B2D3B4”). DM1 (,3iD2B3B4”), DM2 (mB1D2D3B4”), AMI 10 („BjB^Dp^’) és HRÍ43 („DjD2B3B4”). A transzformált törzseket tenyésztjük. A sejteket leszüreteljük és az interferon titereket, mint fent, meghatározzuk. Az IFN-titerek a következők voltak: S.cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AMI 19:5-10^ egység/ml S.cerevisiae GRF 18/pJDB207 PH05/IFN AM106:7-107 egység/ml S.cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/EFN AM 112:210* egység/ml S.cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM1:3-109 egység/ml S.cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN DM2: 5-109 egység/ml Sxerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN AMI 10:310* egység/ml S.cerevisiae GRF18/pJDB207 PH05/IFN HRi 43:1 109 egység/ml. Ugyanüyen körülmények között a S.cerevisiae GRF18/pJDB207/IFN(a-2) és IFN(a-3) törzsek (100561 számú európai szabadalmi bejelentés) titere 110*, illetve 3-109 egység/ml volt. 14. példa „BxD'2PtPa” hibrid interferon termelése transzformáit élesztősejtek segítségével, 30 liter mennyiségben A pJDB207 PH05/IFN AM 129 plazmidot - a plazmid a „BjD2D3D4” hibrid interferont kódoló gént a PH05 savanyú foszfatáz promotertől lefelé (downstream) tartalmazza - hordozó GRF 18 élesztőtörzset YNB (Difco lab.) agar táptalaj felületére szélesztjük. A lemezt 30 °C-on inkubáljuk, amíg a tenyészet összefolyik. Steril kacsot használva, a felületi tenyészetből egy részt átviszünk rázott lombikba, amely az előtenyészethez szükséges IFN/21 táptalajt tartalmazza. Ennek összetétele a következő: 6 10 16 20 25 30 35 40 45 50 55 60 19
