203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 dosított Eagle-tápoldat, a Minimum Essential Medium (MEM), az RPMI 1640 tápoldat és így tovább, adott esetben szérummal, például 10-15% fetális borjúszérummal kiegészítve. A sejtnövekedés kezdetén előnyös, ha falósejteket adunk hozzájuk, például normál egér peritoenális exszudátum sejtekre, lépsejteket, csontvelő makrofágokat, vagy ezekhez hasonlót. A tápoldatot szabályos időközönként szelektív HAT- táptalajjal egészítjük ki, nehogy a normál myeloma sejtek túlnövekedjenek a hibridoma sejteken. A hibridoma sejttenyészet felülúszóját a kívánt monoklonális antitestre nézve vizsgáljuk, előnyösen egy kombinált immunprecipitációs biossay-val vagy radio-immunassay-vel. A pozitív hibridoma sejteket klónozzuk, például határhígításos módszerrel, előnyösen kétszer vagy többször. A klónozott sejtvonalakat a szokásos módon lefagyaszthatjuk. A találmány szerint alkalmazott antitestet és/vagy származékait felhasználhatjuk a természetes eredetű vagy rekombináns DNS-módszerekkel előállított humán IFNa szubtípusok és humán hibrid IFN-ek, különösen a találmány szerinti eljárással előállított hibrid IFN-ok minőségi és mennyiségi meghatározásánál és tisztításánál. Például a monoklonális antitestet vagy származékait - ez lehet enzimkonjugátum vagy radioaktív származék - bármelyik olyan ismert immunassay-ban fel lehet használni, amely az antigén determináns - például egy EFNa aktivitású polipeptid antigén determinánsa - és a monoklonális antitest közti keresztkötéses reakción alapszik. Példaként említjük a következő vizsgálati módszereket: radioimmunassay, enzim immunassay, immunfluoreszcencia, latex agglutináció és hemagglutináció. Ezek az immunassay-k például a természetes eredetű vagy génmanipulált mikroorganizmusból származó IFNa és hibrid IFNa promoterek termelésének és tisztításának az irányításánál hasznosíthatók, továbbá az IFNa és hibrid IFNa minőségi és mennyiségi meghatározására használhatók biológiai folyadékokban, például olyan betegek testfolyadékában, akik IFNa kezelést kapnak, vagy szükségük van üyen terápiára. A találmány szerinti eljárásban felhasznált monoklonális antitest eredeti és radioaktív izotóppal jelzett származék formájában radi^immunassay-ben (RIA) alkalmazható. Az IFNa dirdkt v^y indirekt (kompetitiv) meghatározásánál a RIA-nak bármelyik ismert módosított változata használható. Például a homogén fázisú RIA, szilárd fázisú RIA vagy heterogén fázisú RIA és a szinguláris vagy kettős (szendvics) RIA. ftt a szendvics RIA az előnyös, amelyben a megfelelő hordozó például egy mikrotitráló lemez vagy egy műanyag kémcső felülete, mely lehet például polisztirol, polipropüén vagy polivinü-klorid. Hordozók lehetnek továbbá üveg- vagy műanyag gyöngyök, szűrőpapír vagy dextrán, cellulóz-acetát vagy nitrocellulóz lemez és ehhez hasonlók, mindezek egy IFNa szubtípusra specifikus monoklonális antitesttel vannak fedve egyszerű adszorpció révén vagy pedig esetenként a hordozó aktiválása révén, melyet glutár-aldehiddel vagy brómciánnal végzünk. Az így készített hordozót a vizsgálandó oldattal és egy ^5I-dal jelzett radioaktív monoklonális antitestet tartalmazó oldattal együtt inkubáljuk. Az oldatban lévő monoklonális antitest az IFNa szubtípus más etiópját ismeri fel, mint a hordozóhoz kötött monoklonális antitest, így az IFNa vagy hibrid IFNa mennyiségét a hordozóhoz kötődött radioaktivitás mértékével határozzuk meg. Egy ilyen előnyös radio-immunassay-ben vagy a hordozóhoz kötött antitest vagy a jelzett antitest a jelen találmány szerinti eljárásban felhasznált monoklonális antitest vagy ennek származéka, mint ahogy ezt az előzőekben leírtuk, a másik antitest egy olyan IFNa elleni monoklonális antitest, amely a jelen találmány oltalmi körén kívül esik, vagy egy poliklonális antitest, adott esetben radioaktív izotóppal jelzett származéka formájában. Különösen előnyös az előbbiekben leírt szendvics radio-immunassay, amelyben a találmány szerinti eljárásban alkalmazott monoklonális antitest gyöngyhöz van kötve, például polisztirol gyöngyhöz és a fedett gyöngyöt IFNa-t vagy hibrid IFNa-t tartalmazó standard tesztoldatban inkubáljuk, amelyet végül olyan radiológiailag jelzett monoklonális antitesttel hívunk elő, amely egy másik IFNa epitopot ismer fel. A 4. és 5. ábra a hordozóhoz kötött radioaktivitást ábrázolja a tesztoldatban lévő IFNa/B szubtípushoz tartozó IFN-a-2 polipeptid mennyiségének függvényében. A meghatározás szendvics RIA-val történt, amelyet a kísérleti részben részletesen ismertetünk. A RIA érzékenysége 150-5000 NE/ml IFN-a-2 szubtípust tartalmazó oldat gyors és megbízható mennyiségi meghatározást teszi lehetővé, vagy ha egy sokkal időigényesebb módszert választunk, akkor egy NEAnl mennyiségű IFN-a-2 szubtípust is meghatározhatunk. Hasonló eredményekhez jutunk más EFNa szubtípushoz tartozó polipeptidek szendvics RIA-val való meghatározása esetén, például az IFNa/D szubtípus vagy az IFNa/F szubtípus és főként a találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok meghatározása esetén. A találmány szerint a monoklonális antitestet fel lehet használni eredeti formájában vagy enzimmel konjugált származéka formájában enzim-immun assayben. Az üyen immunassay-k olyan vizsgálati eljárást foglalnak magukba, melyben a következők kerülnek felhasználásra: enzimmel jelzett találmány szerinti monoklonális antitest származék; enzimmel jelzett ismert antitest, amely felismeri és megköti a 144BS anti- IFNaantitestepitópjait;másanti-IFNaantitestek. Előnyös az ELISA (enzyme-linked immunadszorbent assay) módszer, amelyben egy a RIA-nál fent leírt hordozót monoklonális antitesttel fedünk, ezt az EFNa-t tartalmazó teszt-oldattal, majd egy IFNa elleni poliklonális szérummal például juhszérummal inkubáljuk és végül a poliklonális szérumból megkötött antitesteket olyan enzimmel jelzett antitestekkel hívjuk elő, amelyek ezeket felismerik és megkötik, s a megkötött IFNa mennyiségét enzim-szubsztrátum reakcióval határozzuk meg. Ilyen enzimmel jelzett anti5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
