203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 test például a foszfatázzal jelzett kecske anti-birka immunglobulin. Ugyancsak előnyös egy olyan ELISA, amelyben egy IFNa szubtípusra specifikus monoklonális antitesttel fedett hordozót az IFNa-t tartalmazó tesztoldattal és egy enzimmel kunjugált monoklonális antitestet tartalmazó oldattal inkubálunk, s az oldott monoklonális antitest az IFNa szubtípusnak más epitópját ismeri fel, mint amit a hordozóhoz kötött monoklonális antitest. A megkötött enzim mennyiségét, amely arányos a tesztoldatban lévő IFNa vagy hibrid IFNa szubtípus mennyiségével, enzim-szubsztrátum reakció segítségével - a reakció például színváltozást eredményez, amelyet szemmel vagy optikai mérőmódszerekkel észlelhetünk - mérjük meg. Különösen előnybe helyezzük az immunodot analízisnek nevezett enzim immunassayt, amelyben az IFNa-t vagy hibrid IFNa-t tartalmazó vizsgálandó vagy standard oldatot olyan mikroporózus hordozóra, például nitrocellulózra cseppentjük, amelynek nagy a belső affinitása polipeptidekhez. A hordozót, melyen az említett IFNa-t tartalmazó mintákból egy vagy több folt van, a találmány szerinti monoklonális antitest oldatában inkubáljuk, majd egy enzimmel jelzett második antitest oldatában, mely utóbbi antitest felismeri és köti a találmány szerinti monoklonális antitestet, végül egy olyan szubsztrátum oldatban inkubáljuk, amely észlelhető jelet, például színes vegyületet eredményez. Ilyen enzimmel jelzett második antitest például a torma peroxidázzal konjugált nyúl anti-egér immunglobulin, s ezt megfelelő szubsztrátummal, például 4-kloro-1 - naf tollal vagy hasonló vegyülettel hívhatjuk elő. A BS144 monoklonális antitestnek és származékainak a felhasználása - amint ezt az előbbiekben leírtuk - az IFNa szubtípusok vagy a hibrid IFNa minőségi és mennyiségi meghatározásához szolgáló más közismert immunassay-ket is magában foglal, például immunfluoreszcenciás vizsgálatokat, ahol fluoreszkáló anyagokkal előállított antitest-konjugátumok vagy antigén-kon jugátumok kerülnek alkalmazásra, továbbá a latex agglutinációt, ahol antitesttel vagy antigénnel fedett latex-partikulák szerepelnek vagy a hemagglutinációt, amelyben antitesttel vagy antigénnel fedett vörösvérsejteket használunk és így tovább. A tesztkészletek, amelyek a találmány szerinti eljárással előállított IFNa szubtípusok és a hibrid IFNa minőségi és mennyiségi meghatározását szolgálják, a 144 BS monoklonális antitestet és/vagy ennek egy származékát tartalmazzák és adott esetben humán IFNa elleni más monoklonális vagy poliklonális antitesteket és/vagy kiegészítő anyagokat. Például egy radio-immunassay-hez összeállított tesztkészlet tartalma a következő: megfelelő hordozó, amely lehet fedetlen vagy IFNa-val szembeni monoklonális antitesttel fedett, adott esetben IFNa elleni monoklonális vagy poliklonális antitest liofilizálva, vagy koncentrált oldatban és/vagy ezek radioizotóppal jelzett származéka. A készletben a monoklonális antitestek közül legalább az egyik - vagy a hordozóhoz kötött, vagy az oldatban lévő, vagy a jelzett - a találmány szerinti monoklonális antitest. A készlet tartalmazhat továbbá standard humán IFNa oldatokat, puffer oldatokat és esetenként polipeptideket és detergenseket az aspecifikus adszorpció és aggregátumképződés megakadályozására, ezenkívül pipettákat, edényzetet a reakciókhoz, kalibrációs görbéket és így tovább. Egy enzim immunassay-hez szolgáló tesztkészlet tartalma például a következő: megfelelő hordozó, IFNa elleni monoklonális és/vagy poliklonális antitest liofüizálva vagy koncentrált oldat formájában, IFNaval vagy az IFNa-t felismerő első antitesttel szembeni enzimmel jelzett monoklonális vagy poliklonális antitest, ahol az IFNa elleni monoklonális antitest vagy az enzimmel jelzett IFNa elleni antitestszármazék közül legalább az egyik a találmány szerint felhasznált monoklonális antitest vagy ennek származéka. Tartalmaz a készlet továbbá szubsztrátumot oldatlan vagy oldott formában, standard humán IFNa oldatokat, pufferoldatokat és adott esetben polipeptideket és detergenseket, pipettákat, reakcióedényeket, kalibrációs görbéket, színskálatáblázatokat és így tovább. A természetes eredetű IFNa-t vagy IFNa szubtípusokat, vagy az IFNa-val rokon polipeptideket, amilyenek a találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok is, immunaffinitáskromatográfiával tisztíthatjuk, a találmány szerinti monoklonális antitest segítségével. A monoklonális antitestet vagy ennek származékát alkalmas szerves vagy szervetlen hordozóhoz kötjük, esetenként ezek aktiválása után, üyen a térhálós agaróz, a dextrán vagy a poliakrilamid. E műveletet a szakterületen ismert általános módszerekkel végezzük. Például egy aktivált észter funkcióval rendelkező hordozót vizes puffer oldatban szuszpendálunk, elkeverjük a monoklonális antitest vagy származéka oldatával, leszűrjük, reszuszpendáljuk, majd mossuk a feleslegben lévő monoklonális antitest eltávolítására. A hordozót ezután egy irreleváns proteineket tartalmazó oldattal kezeljük, hogy blokkoljuk a hordozó szabad, reaktív helyeit. Az így kapott, antitesttel fedett hordozót használjuk arra, hogy szelektíven megkösse a humán IFNaszubtípusokat, például az IFNa/B, IFNa/D és IFNa/F szubtípusokat és a rokon polipeptideket, amilyenek például a találmány szerinti eljárással előállított hibrid interferonok glükozilált vagy nem glükozilált alakjai. Ezután a hordozóanyagot megfelelő vizes oldatban szuszpendáljuk, például sóoldatban - üyen a nátrium-kloridoldat - vagy pufferoldatban - üyen a foszfáttal pufferolt NaCl-oldat - vagy nátrium-hidrogén-karbonát vagy 3-(N-morfolino)propán-szulfonsav-oldatban, majd összehozzuk az IFNa-tartalmú oldattal, például úgy, hogy betöltjük egy kromatografáló oszlopba és az IFNa-t tartalmazó oldatot rávisszük az oszlopra és átszívatjuk a hordozóanyagon, s ha kívánt, nyomás alatt. A kötetlen proteineket és az egyéb szennyezőanyagokat kimossuk az oszlopból vizes oldatokkal, például körülbelül 5-9 pH tartományon belüli pufferoldatokkal és/vagy sóoldatokkal, például NaG-oldattal. A hordozón lévő anti5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
