203255. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid interferonok előállítására
1 HU 203 255 B 2 a) in vitro tenyésztjük és a tenyészet felüiúszójából izoláljuk a monoklonális antitestet, vagy b) in vivo szaporítjuk alkalmas emlősszervezetben és monoklonális antitestet az illető emlős testfolyadékaiból izoláljuk és, ha kívánt, c) a monoklonális antitestet egy származékává konvertáljuk. Az a) eljárás szerinti in vitro tenyésztéshez megfelelő táptalajok a standard táptalajok, üyen a Dulbecco-féle módosított Eagle tápoldat vagy az RJPMI1640 tápoldat, amelyeket alkalmanként emlősszérummal, például fetális borjúszérummal egészítünk ki. A monoklonális antitest izolálása úgy történik, hogy a tenyészet felülúszójában levő proteint ammóniumszulfáttal vagy ehhez hasonló anyaggal kicsapjuk, majd az immunglobulint standard kromatográfiás módszerekkel - üyen a gélszűrés, ioncserélő kromatográfia, kromatografálás DEAE cellulózon vagy immun-affinitáskromatográfia - tisztítjuk. A kívánt monoklonális antitestből nagy mennyiségeket kaphatunk, ha a hibridoma sejtvonalat a b) eljárás szerint szaporítjuk el. A sejtklónokat szingenetikus emlősökbe oltjuk, ahol antitesttermelő tumorok keletkeznek Egy-három hét elteltével a kívánt monoklonális antitestet az illető emlős testfolyadékaiból izoláljuk. Például a Balb/c egérből származó hibridóma sejtvonalat olyan Balb/c egerekbe oltjuk interperitoneálisan, amelyeket ez esetben egy szénhidrogénnel, például Pristane-nal (2,6, 10, 14-tetrametü-pentadekán), előkezeltünk és egy vagy két hét elteltével az egerek aszcitesz folyadékát összegyűjtjük. A testfolyadékokból ismert módszerekkel izoláljuk a monoklonális antitestet, például úgy, hogy a proteint ammóniumszulfáttal vagy ehhez hasonló anyaggal kicsapjuk, ezt követi az immunglobulin tisztítása standard kromatográfiás módszerekkel, mint gélszűréssel, ioncserélő kromatográfiával, DEAE ceüulózon való kromatografálással vagy immunaffinitáskromatográf iával. A monoklonális antitestek fragmentumait, például a Fab, Fab’ vagy F(ab’>2 fragmentumokat, amelyek az EFNa szubtípusok antigén determinánsaival szembeni specificitásukat megtartják, olyan monoklonális antitestekből kaphatjuk meg, amelyeket az a) vagy b) eljárással, ismert módszerekkel, például enzimes emésztéssel - például pepszinnel vagy papainnal - és/vagy a diszulf id kötések kémiai redukciójával állítunk elő. Radioaktív jóddal jelzett monoklonális antitesteket a szakterület ismert jódozási módszereivel állítunk elő, például úgy, hogy a monoklonális antitestet radioaktív nátrium- vagy kálium-jodiddal jelezzük, kémiai oxidálószerrel, üyen a nátrium-hipoklorit, kloramin-T vagy hasonlók, vagy oxidáló enzimmel, üyen a laktoperoxidáz, glükóz-oxidáz és glükóz. A találmány szerint alkalmazott radioaktív, jelzett monoklonális antitesteket úgy is előállíthatjuk, hogy az a) lépés szerinti in vitro tenyésztés esetén a táptalajhoz radioaktív jelzéssel eüátott tápanyagokat adunk. Az üyen jelzett tápanyagok például radioaktív szenet (14C), tritiumot (3H), ként (35S) stb. tartalmaznak, példa ezekre az L(l4C)-leucin, L-(3H)-leucin vagy az L-(35S)-metionin. A találmány szerint felhasznált monoklonális antitest konjugátumok előállítása a szakterület ismert módszerei szerint történik, például az a) vagy b) lépés szerint termelt monoklonális antitestet vagy ennek egy fragmentumát - amelyet az előbbiekben leírtak szerint készítettünk - enzimmel reagáltatjuk, konjugálószer jelenlétében, üyen például a glutáraldehid, perjodát, NN’-o-fenfléndimalein-imid,N’{m-malein-imidobenzoü-oxi)-szukcin-imid, N-etü-N’-(3’-dimetü-aminopropü)-karbodiimid és így tovább. A biotinos konjugátumok például úgy készülnek, hogy a monoklonális antitestet egy aktivált biotio-észterrel - üyen a biotin-N- hidroxi-szukcinimid-észter - reagáltatjuk. A 144 BS 22-6-19 nevű hibridoma sejtvonalat 1985 március 14-én letétbe helyeztük a párizsi Pasteur Intézetben a „Coüection Nationale de Cultures des Microorganismes” gyűjteményében, 1-424 letéti szám alatt. Az a hibridoma sejtvonal az Sp2/0-Agl4 egér myeloma sejtvonal és természetes humán IFNa-val immunizált Balb/c egér-lép egy B limfocitájának a hibridje. Ez egy stabü sejtvonal, amely a 144 BS jelű monoklonális antitestet szekretálja. A sejtvonal fenntartható tenyészetben és folyékony nitrogénben mélyfagyasztva, ahonnan felolvasztással reaktiválható. A 144 BS monoklonális antitestet szekretáló hibridoma sejtvonal előáüítási eljárása a következő lépésekből áll: Balb/c egereket immunizálunk természetes humán EFNoc-val, az egér antitest-termelő lép sejtjeit az Sp2/0-Agl4 myeloma sejtekkel fuzionáljuk, majd kiválasztjuk a kívánt antitestet szekretáló sejtklónt. Az egér immunizálását úgy végezzük, hogy például a természetes humán IFNat négyszer parenterálisan - intraperitoneálisan és/vagy szubkután - injiciáljuk 10-40 nap időközönként körülbelül 105-10° NE dókomplett vagy inkomplett Freund adjuváns - tartalmaznak, amely stimulálja a limfocitatermelődést. Az utolsó emlékeztető oltás után kettő-öt nap múlva kivett antitest lépsejteket az Sp2/0-Ag 14 myeloma sejtvonal sejtjeivel fuzionáljuk fúziós promoter jelenlétében. Fúziós promotereknek tekintjük például a Sendai vírust vagy más paramyxo vírusokat, esetenként UV-besugárzással inaktivált formában, a kalcium-ionokat, felületaktív lipideket, üyen a lizolecitin vagy a polietüénglikol. Előnyös, ha a myeloma sejteket az immunizált egerekből származó lépsejteket három-hússzoros feleslegében, 1000-4000 molekulasúlyú polietüén-glikolból 30-60%-ot tartalmazó oldatban fuzionáljuk. Fúzió után a sejteket reszuszpendáljuk és szelektív HAT táptalajban tenyésztjük Ekkor csak a hibridoma sejtek lesznek túlélők, mivel ezek egyesítik magukban az in vitro növekedés és replikádé képességét. Ezt a képességet egyrészt a myeloma sejtektől örökölték, amelyekből ugyan hiányzik a HAT táptalajban való túlélés szempontjából esszenciális HGPRT vagy TK gén, azonban ezeket a géneket az immunizált egerek antitesttermelő lépsejtjeiből örökölték A hibridoma sejtek szaporítására alkalmas táptalajok a standard táptalajok Dyenek a Dulbecco-féle mó5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
