203251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új ciklusos aminosav-származékok és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

1

HU 203 251 B

2

A példa

száma

Tömegspektrum

(DCI.M+H)

119

419

120

391

Fannakológiai példa

A) Eljárás

Propü-endopeptidáz forrásként patkány agyból nyert homogenizátumot használtunk. A szövet kivonatokat 1 '3 arányban (tömeg/térfogat) készítettük 4 °C hőmérsékleten Ultraturrax homogenizáló berendezésben való homogenizálássál nátrium-foszfát-pufferben (50 mmól, pH=7,2), amely EDTA-t (1 mmól) és ditiotreitet (2 mmól) tartalmazott. Az extraktumokat lOOOOOxgérték mellett 60 percig centrifugáltuk, és a kapott felülúszót használtuk az enzim aktivitás meghatározására. A prolil-endopeptidáz aktivitást fluorometriásan mértük Kató és mtsai. [J. Neurochem, 35, 527-535 (1980)] szerint. A vizsgálat lényege azon alapult, hogy a fluorogén anyagból, a 7-N-szukcinü-glicil-prolü)-4-metü-kumar in-amidből (szukcinil-gly-pro-MCA) enzimatikus hasítással szabaddá váló 7-amino-4-metil-kumarinnak (7- AMC) a mennyiségét határoztuk meg fluoreszcenciásan.

Az inkubációs elegy (össztérfogata200 (jű) 124 jxl nátrium -foszfát-pufferből (50 mmól, pH=6,8) állt, amely EDTA-t (1 mmól) és ditiotreitet (2 mmól) tartalmazott, az elegy tartalmazott ezenkívül 6 pl enzim-oldatot és 20 pl vizsgálati vegyület oldat ot. 2 percig 37 °C hőmérsékleten végzett előinkubálás után az enzim reakciót 50 pml szubsztrát oldatnak (2 mmól) az adagolásával indítottuk. Ezután 10 percig inkubáltuk az elegyet 37 °C hőmérsékleten vízfürdőn való rázás közben, majd a reakciót 2 ml nátrium-acetát-puffemek (1 mól, pH=4,0) az adagolásával leállítottuk. A kontroll minták minden reagenst tartalmaztak, kivéve a vizsgálati vegvületeket, ezeket a mintákat a leírtakhoz hasonlóan kezeltük. Az inkubációs elegy vak-értékének a meghatározásához a nátrium-acetát-puffért a szubsztrátum előtt adagoltuk. Az oldat floureszcenciás intenzitását 435 nm-nél vizsgáltuk, 370 nm-es hullámhosszal való gerjesztésnél Perkin-Elmer LS-3 fluoreszcenciás spektrométerben.

A vizsgált vegyületek gátló hatását IC50 értékben fejeztük ki, ez azt a moláris hatóanyag koncentrációt jelenti, amely a prolü-endopeptidáz aktivitásnak 50%-os csökkenését okozza. Az IC50 értékeket grafikusan határoztuk meg a log koncentráció-válasz görbékből négy vagy öt hatóanyag-koncentrációnál legalább háromszori ismétlésben.

B) Eredmények

Példa száma

IC50 (nmól)

2

0,055

8

3

9

0,65

10

0,45

Példa száma

IC50 (nmól)

11

0,5

12

0,8

13

18

15

0,6

16

10

18

1,3

19

0,3

20

35

21

0,13

33

2,5

73

10

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek a -képletben

R1 jelentése hidrogénatom, Cj^-alkü- vagy

fenilcsoport,

R2 jelentése C] 0-C, 7-alkenil-, feni!-, fenoxi-,

benzil- vagy benzoilcsoport, és a fenü- és fenoxicsoport adott esetben egyszeresen helyettesítve lehet Cj-C6-alkil-, C2-C4- alkenü-, C1-C4-alkoxi-csoporttal, halogénatommal, benzil-, fenoxi-, benzoüvagy fenil-C2-C4-alkenil-csoporttal vagy kétszeresen C1-C4-alkoxicsoporttal, vagy

R'ésR2 együtt benzüidéncsoportot alkot, amely adott esetben egyszeresen, kétszeresen vagy háromszorosan azonosan vagy különbözően helyettesítve lehet Cl-C4 alkoxicsoporttal,

A jelentése az (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8),

(9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16). (17), (18), (19), (26) képletű csoport, vagy (20) általános képletű csoport - a képletben

R4ésR5 jelentése azonos vagy különböző és jelentéseük hidrogénatom, fenü-, 5-8 szénatomos cikloalkü-, vagy Cj_4 alkücsoport, azzal a kikötéssel, hogy legfeljebb egyik jelentése hidrogénatom,

R3 jelentése hidrogénatom, hidroxi-metüvagy formücsoport, vagy (21), (22), (23), -CO-CF?; -C0-CF2-C02R9;-C0- CF2-R10 vagy (24) általános képletű csoport - a képletekben

R8 jelentése karboxü-, (Cj-C6

alkoxi)-karbonü-csoport, vagy (25) általános képletű csoport;

R9 jelentése Cj -C6-alkücsoport,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

24