203205. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterin liposzómák előállítására
1 HU 203 205 B 2 szert a liposzómába annak előállítása során építik be, majd a kezelendő páciensnek beadják. A gyógyszer oldódhat vízben vagy egy nem poláris oldószerben. Ezekre vonatkozó ismertetések találhatók a 4 235 871 és 4 224179 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban. Ha liposzómákat in vivo használatra állítanak elő, akkor előnyös 1. kiküszöbölni a szerves oldószerek alkalmazását a liposzómák előállítása során; és 2. a beépülés hatásfokát és a bezárt térfogatot maximalizálni úgy, hogy egy dózis a beépült anyag nagyobb térfogatát és koncentrációját szolgáltassa. Vízoldható szterinek Számos különböző szterint és vízoldható származékaikat használják kozmetikai, gyógyszerészeti és diagnosztikai célokra. A vízoldható szterinek közül például az elágazó láncú zsírsavak koleszterin-észtereit, szteroid-észtereket és PEG-fitoszterineket alkalmazták eddig kozmetikai készítményekben [28 456 számú európai szabadalmi bejelentés; 4 393 044 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Scharader: Drug and Cosmetic Industry 33. és 46. oldal (1983)]. Thakkar és Kuehn [J. Pharm. Sei., 58, (7), 850-852 (1969)] ismertetlek a szteroid hormonok szolubüizálását, szteroidos nem-ionos felületaktív anyagok, specifikusan etoxilezett koleszterin (vagyis PEG-koleszterin) vizes oldatait használva 1-5% koncentrációban. Nem bizonyították azonban a szolubüizált szteroid-hormonok in vivo hatékonyságát vagy használhatóságát. Számos vízoldható koleszterint készítettek és alkalmaztak mint vízoldható standardokat koleszterin-szintek meghatározására biológiai folyadékokban [3 859 047,4 040 784,4 042 330,4183 847, 4 189 400 és 4 224 229 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások], Shinitzky és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 5313-5316 (1979)] tumorsejteket inkubáltak szövet táptalajon, amely kis koncentrációban koleszterint és koleszterin-hemiszukcinátot tartalmazott. A koleszterin vagy a koleszterin-hemiszukcinát beépülése a sejtmembránba csökkentette a membrán cseppfolyósságát és növelte a membrán-lipid mikro-viszkozitását. Koleszterint és más szterineket beépítettek foszfolipid liposzóma-membránokba is, hogy a lipid kettős rétegek fizikei tulajdonságait megváltoztassák. így például Ellens és munkatársai [Biophys. J. 45, 70a (1984)] ismertetik a H+ hatását a foszfatidil-etanolból és koleszterin-hemiszukcinátból álló lipid-vesiculák stabüitására. Brockerhoff és Ramsammy [Biochim. Biophys. Acta, 691, 227-232 (1982)] szerint előállítók olyan kettős rétegek, amelyek teljes egészében koleszterinből állnak, feltéve, hogy egy stabilizáló hidrofil segédanyagot alkalmaznak. Multilamelláris és unüamelláris koleszterin-liposzómákat készítettek a fentiekben ismertetett hagyományos módon úgy, hogy a koleszterin-származékokat (például koleszterin-foszfokolint, koleszterin-polietüénglikolt vagy koleszterin-S04-ot) egy szerves oldószerben diszpergálták, bepárolták, és így a reaktorban egy lipid-film maradt vissza. A lipid-filmet 2 ml víz alatt ultrahanggal kezelték, mikroheggyel felszerelt ultrahang-homogenizátort használva. A multilamelláris liposzómák képzéséhez 10 perc, míg a kis unüamelláris liposzómák képzéséhez 4 órás ultrahangkezelés volt szükséges. A multüamelláris liposzómák így kapott szuszpenziói tejszerűek voltak, míg az unüameüáris liposzómáké átlátszóak. Mind ez ideig nem tudtak azonban eredményesen beépíteni bioaktív anyagokat szterin-liposzómákba, amelyek alkalmasak in vivo beadásra, a beadáshoz vízoldható anyagok nagyobb dózisait biztosítva és megkönnyítve a vízben nem oldódó szerek beadását. A találmány tárgya eljárás különböző vegyületek beépítésére alkalmas szterin liposzómák előállítására, amelyek kettős rétegei koleszterin szerves savszármazékainak sóformáiból állnak. Egy vegyület beépítése azt jelenti, hogy egy vízoldható vegyületet beépítünk a liposzóma vizes részébe, vagy egy vízben oldhatatlan vegyületet beépítünk a szterin kettős rétegbe. A szterinek szerves savszánnazékainak trisz(hidroxi-metü)amino-metán sóformái kiváltképpen használhatók , mint liposzóma kettős réteg komponensek. A találmány szerinti eljárás során egy vizes pufferhoz hozzáad juk a koleszterin egy szerves sav-származékának valamely sóformáját - amely zárt kettős rétegeket tud képezni - olyan mennyiségben, előnyösen egy 2-6 mmól koncentrációjú oldatban, amely elegen- s dő ahhoz, hogy tökéletesen zárt kettős rétegek jöjje- y nek létre, s ezek vizes rekeszeket zárjanak magukba. A , multüamelláris liposzómák szuszpenzióját a keverék , rázásával képezzük. A liposzómák képződését meg- . könnyíti, ha a vizes puffer a só eüenionját is tártál- r mázzá az oldatban. Továbbá, ha a koleszterin szerves savszármazékának disszociált sóformája semleges pH-értéken negaív töltésű, akkor a vizes puffemak lényegüeg mentesnek keü lennie két- vagy többvegyértékű kationoktól. Hasonlóképpen, ha a koleszterin szerves savszármazékának disszociált sóformája semleges pH-értéken pozitív töltésű, akkor a vizes puffernak lényegüeg mentesnek keü lennie többvegyértékű anionoktól. Energia alkalmazása a szuszpendálás, példáid ultrahangos kezelés vagy a liposzómák átsajtolása French pressure ceüán vagy egy megfelelő pórusméterű porózusszűrőn, a multüameüáris szterin liposzómákat unüameüáris liposzómákká alakítja. Arra a célra, hogy a találmány szerinti szterindiposzómákba vízoldható vegyületeket, részben vízoldható vegyületeket, vagy vízben oldhatatlan vegyületeket beépítsünk, számos lehetőség kínálkozik. A vizes fázishoz adhatunk a szterin kettős rétegekben elosztó vegyületeket (például vízben oldhatatlan vegyületeket) vagy vízoldható vegyületeket, mielőtt a liposzómákat képeznénk, hogy a vegyületeket a liposzómákba azok előáüítása során beépítsük Eljárhatunk úgy is, hogy vízben oldhatatlan vagy a lipidben oldható vegyületeket adunk a szterin liposzómák szuszpenziójához, miután a liposzómákat előáüítottuk, ebben az esetben a vegyület eloszlik a szterin kettős rétegekbe. Egy másik kiviteli mód szerint egy vízoldható vegyüle-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
