203201. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellenes szinergetikus hatású gyógyászati készítmény előállítására
1 HU 203 201 B 2 nagyobb molekulák behatolását. Ez az alapja a vér-agy gát létezésének; eszerint a vérben oldott anyagoknak, amikor be akarnak hatolni az agyba, az endotélsejteken kell átdiffundálniuk. Ebből következik, hogy az endotélen való áthatolás után még egy viszonylag hosszú úton kell tovább diffundálniuk a gliasejtek nyúlványai mentén. Ezzel szemben más szövetmembránokon való áthatolásnál nincs szó ilyen további barrierekről (gátakról), minthogy ezek csak az agyban fordulnak elő, hanem itt nagyobb molekulák hatolnak át az endotélen, mivel a test többi területén az endotélen nagyobb nyílások vannak az ilyen diffúzió megkönnyítése számára. A bőrön át történő diffúziónál (amely találmányunk különleges alkalmazási területe) a penetráció folyamata egészen más, mivel itt az endotéllel szemben a hámszöveten és további testmembránokon történik az áthaladás. Amikor különböző anyagok az emberi bőrön áthatolnak, az áthatolásnak a következő rendszerek állnak eUen: 1. A bőrfelszín, azaz a) a bőrzsír filmje b) a szaruréteg stratum disjunctuma c) a szaruréteg stratum conjunctuma, beleértve a SZAKALL-féle barriereket. 2. Az epidermisz (felhám, epitél) élő sejtrétegei, azaz a) a viszonylag összefüggő stratum spinosum b) a stratum basale lazábban összefüggő rétege. 3. Az epidermális határmembránok 4. A corium (kötőszöveti réteg) alapállománya 5. A vér- és nyirokrendszer érfalai, melyek a bőr ereibe való reszorpciónál az utolsó ellenállást képezik. E tényből már az is következik, hogy ha eg)' adott anyag penetrációja a vér-agy gáton át megy végbe, a bőr esetében egyáltalán nem szükségszerű, hogy ez ugyanígy történjék, vagy ez várható lenne. Kísérleti eredmények Citotoxicitás meghatározása a KB sejtvonalon MIT-teszt segítségével A 3-(4,5-dimetü-tiazol-2-ü)-2,5-difenü-tetrazólium-bromid (MIT) intracelluláris redukciója az életképes sejtek egyik funkciója. A MIT-teszt egyszerű kolorimetriás mérőmódszer a citotoxicitás meghatározására. Anyagok A KB-sejtek laphámrákból származó emberi sejtvonalnak felelnek meg, amelyek szövettenyészetben tarthatók fenn. A 3-(4,5-dimetü-tiazol-2-ü)-2,5-difenil-tetrazólium-bromidot (MIT; Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) PBS-pufferben (Seromed, Berlin) oldjuk 5 mg/ml végkoncentrációban, és steril szűrés után (0,2 pm pórusméret) alikvot részeit -20 °C-on lefagyasztjuk későbbi felhasználáshoz. A 0,04 növény HCl/izopropanol elegyet laboratóriumi minőségű reagensekből állítjuk elő. Módszer A KB-sejtek szuszpenzióját tápfolyadékkal kívánt töménységűre állítjuk be. Hozzáadjuk a vizsgálandó vegyületeket és minden további hígítást ebből a mintából állítunk elő, hígító folyadékként a beállított sejtszuszpenziót használva. Mikrotiter lemezek (Falcon Heidelberg, NSZK, 3072 modell) furataiba 100 pl vegyület/sejtszuszpenzió keveréket töltünk, majd a lemezeket 37 °C-on 95% relatív páratartalomnál 5-10% C02 - levegő atmoszférában inkubáljuk. A minták értékelése előtt 4 órával 10 pl MIT-oldatot adunk a furatokhoz, majd az inkubálást tovább folytatva a MIT formazánkristályokká alakul át. Végül minden furathoz 100 vl HCl/izopropanol elegyet adunk. Ezután a lemezeket ultrahangos fürdő felszínén (Bandelin-Sonorex, RK510H típus, 35 kHz, 225/450 Watt) hagyjuk lebegni 1-2 percen át. Előkísérletekben meghatároztuk a vízszint optimális magasságát, hogy elkerüljük a minták kiömlését. A kristályok tökéletes feloldódása után a lemezeket mikrolemez-értékelő készülékben „leolvassuk” (Dynatech, Denkendorf, NSZK, 11R600, vizsgálati hullámhossz: 540 nm, referencia hullámhossz: 630 nm). Minden vizsgálandó anyaggal, illetve anyagkeverékkel 24 órás próbát végzünk, miközben a mintákat folyamatosan tesszük ki a szerhatásnak. Egyik értékelési kritérium az EC50 érték kiszámítása (az optikai elnyelést 50%-kal csökkentő hatásos koncentráció). Ezt regressziós analízissel számítjuk ki, a megfelelő kontrollal történő összehasonlítás alapján. A képződött bíborszínű formazán optikai elnyelése a daganatsejtek aktivitásának a függvénye. Ezért a vizsgálandó szerek optikai elnyelésének csökkenése a szer citotoxicitásáról ad felvilágosítást. Egy szernél vagy vegyületkeveréknél minél kisebb az EC50 érték, annál nagyobb az illető szer vagy keverék citotoxicitása. 24 órai inkubálás után magának a bexadecil-foszfokolinnak az EC50 értéke 5,2 pg/ml. 25% vízből, 25% propü-, 25% hexil- és 25% nonilglicerinéterből álló 1%-os glicerinéter-keverék nem befolyásolja a sejtek növekedését. Ezzel szemben a hexadecil-foszfokolin EC50 értéke 5,3 pg/ml-ről 0,3 pg/ml-re csökken 1% fent megadott glicerinéter-keverék hozzáadása után. E kísérletből egyértelműen kitűnik, hogy a glicerinéter-keverék a hexadecü-foszfokolin hatását szinergizmus útján fokozza. C Kísérleti eredmények Hexadecil-foszfokolin/glicerinéter kombináció szinergizmusának (citotoxicitás) meghatározása KB-sejtvonalon a MIT-teszt segítségével Egy tetrazóliumsó (MIT) bíborszínű formazánná történő intracelluláris redukciója a sejt életképességének indikátora. A MIT-teszt a cito-toxicitás meghatározására alkalmas egyszerű kolorimetriás eljárás. Anyagok A KB-sejtek laphámrák-eredetű humán sejtvonal5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
