203201. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellenes szinergetikus hatású gyógyászati készítmény előállítására
1 HU 203 201 B 2 nak felelnek meg, amelyek szövettenyészetben tarthatókfenn. AMIT tetrazóliumsót [3-(4,5-dimetü-tiazol- 2-fl)-2,5-difenü-tetrazólium-bromid, Sigma Qiemie GmbH, Deisenhofen] PBS-pufferben (Seromed, Berlin) oldjuk 5 mg/ml végkoncentrációban, és steril szűrés után (0,2 pm pórusméret) alikvot részeit -20 °C-on lefagyasztjuk későbbi felhasználáshoz. A 0,004 n HQ/izopropil elegyet laboratóriumi minőségű reagensekből állít juk elő. Módszer A KB-sejtek szuszpenzióját tápfolyadékkal kívánt töménységűre állítjuk be. Hozzáadjuk a vizsgálandó vegyűletet és minden további hígítást ebből a mintából állítunk elő, hígító folyadékként a beállított sejtszuszpenziót használva. Mikrotiter lemezek (Falcon Heidelberg, NSZK, 3072 modell) furataiba 100 pj vegyület/sejtszuszpenzió keveréket töltünk, majd a lemezeket 37 °C-on 95% relatív páratartalomnál 5-10% C02 - levegő atmoszférában inkubál juk. A minták értékelése előtt 4 órával 10 pl MIT-oldatot adunk a furatokhoz, majd az inkubálást tovább folytatva a MIT formazánkristályokká alakul át. Végül minden furathoz 100 pl HCl/izopropanol elegyet adunk. Ezután a lemezeket ultrahangos fürdő felszínén (Bandelin-Sonorex, RK510H típus, 35 kHz, 225/450 Watt) hagyjuk lebegni 1-2 percen át. Előkísérletekben meghatároztuk a vízszint optimális magasságát, hogy elkerüljük a minták kiömlését. A kristályok teljes feloldódása után a lemezeket mikrolemez-leolvasó készülékben értékeljük (Dynatech, Denkendorf, NSZK, 11R600, vizsgálati hullámhossz: 540 nm, referencia hullámhossz: 630 nm). Minden vizsgálandó anyaggal illetve anyagkeverékkel 24 órás próbát végzünk, miközben a mintákat folyamatosan tesszük ki a szer hatásának Egyik értékelési kritérium az ECS0 érték kiszámítása (az optikai elnyelést 50%-kal csökkentő hatásos koncentráció). Ezt regressziós analízissel számítjuk ki és %-os gátlás formájában fejezzük ki, megfelelő kontrollal való összehasonlítás alapján. A képződött bíborszínű fonnazán optikai elnyelése a daganatsejtek aktivitásának függvénye. Ezért a vizsgálandó szerek optikai elnyelésének csökkenése a szer citotoxicitásáról ad felvilágosítást. Egy szernél vagy vegyületkeveréknél minél kisebb az EC50 érték, annál nagyobb az illető szer vagy keverék citotoxicitása. 24 órás inkubálás után magának a hexadecü-foszfokolinnak az EC50 értéke 5,3 pg/ml. 25% vízből, 25% propil-, 25% hexü- és 25% nonüglicerinéterből álló 1%-os glicerinéter-keverék nem befolyásolja a sejtek növekedését. Ezzel szemben a hexadecil-foszfokolin EC50 értéke 5,3 pg/ml-ről 0,3 pg/ml-re csökken 1% fent megadott glicerinéter-keverék hozzáadása után. E kísérletből egyértelműen következik, hogy a glicerinéter-keverék szinergista módon fokozza a hexadecü-foszfokolin hatását. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (tumor elleni hatásos) szinergetikus hatású gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve , hogy hexadecü-foszfokolint a szokásos fiziológiailag összeférhető hordozó- és/vagy hígítóanyagokkal, illetve segédanyagokkal 20 °C és 120 °C közötti hőmérsékleten összekeverünk, illetve homogenizálunk, egy (I) általános képletű alkil-glicerinnel - mely képletben az Rj és R2 szubsztituensek egyike egy 2- 12 szénatomos alkilcsoport és a másüt hidrogénatom - vagy Uyen alkil-glicerinek elegyét, valamint adott esetben vizet alkalmazunk, amikor is 1-30 tömegrész (I) általános képletű alkü-glicerint, illetve megfelelő alkü-glicerin elegyet és adott esetben 1-30 tömegrész vizet használunk egy tömegrész hexadecü-foszfokolinra vonatkoztatva, és adott esetben az így nyert keveréket olyan készítmények előállítása céljából, amelyek adagolási egységként 5-2000 mg hexadecü-foszfokolint tartalmaznak, megfelelő nagyságú üreges formákba öntjük vagy megfelelő nagyságú kapszulákba töltjük vagy granuláljuk és azután adott esetben további szokásos adalékanyagok hozzáadása mellett • tablettákká préseljük. (E: 1985.12.04.) 2. Az 1. igénypont szerinti (tumor eüen hatásos):« gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemez- * ve, hogy hexadecü-foszfokolint a következő anyagok közül eggyel vagy többel: cellulóz, laktóz, formalin-kazein, módosított keményítő, magnézium-sztearát, kalcium-hidrogén-foszfát, nagy diszperzitásfokú kovasav, fenoxi-etanol; összekeverjük, a kapott keveréket, adott esetben egy olyan vizes oldattal, amely alkotó-®részként a következők közül legalább egyet: zselatin, keményítő, polivinü-pirrolidon, vinü-pirrolidon-vinü-acetát kopolimerizátum és/vagy polioxietüénszorbitánmonooleát, tartalmaz, granuláljuk, a granulátumot adott esetben az előzőekben említett segédanyagok közül eggyel vagy többel homogenizáljuk és ezt a keveréket tablettákká préseljük, vagy kapszulákba töltjük, mely tabletták vagy kapszulák egyenként 5-2000 mg hexadecü-foszfokolint tartalmaznak. (E: 1986.12.04.) 3. Az 1. igénypont szerinti (tumorok ellen hatásos) gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hexadecü-foszfokolint szójalecitinnel, valamint adott esetben (egy tömegrész hexadedlfoszfokolinra vonatkoztatva) 01-0,5 tömegrész fenoxi-etanollal 33-37 °C-on olvasztott, keményített zsírban szuszpendálunk és homogenizálunk, majd a keveréket üreges formákba öntjük, melyek egyenként 5- 2000 mg hexadecü-foszfokolint tartalmaznak (E: 1986.12.04.) 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás (tumorok ellen hatásos) gyógyászati készítmények (sók, emulziók, krémek) előállítására, azzal jellemezve, hogy hexadecü-foszfokolint 50-120 °C-on, adott esetben egy vagy több emulgeátor és/vagy (egy tömegrész hexadecüfoszfokolinra vonatkoztatva) 0,1 -0,5 tömegrész fenoxi-etano! jelenlétében a következő anyagok közül leg5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
