203201. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorellenes szinergetikus hatású gyógyászati készítmény előállítására
1 HU 203 201 B 2 fokolin a rövidebb, vagy hosszabb láncú foszfokolinszármazékokhoz képest egy váratlan különleges helyzetet f oglal el: a rövidebb láncú származékok messzemenően hatástalanok, míg a láncnak csekély meghosszabbítása (például oktadecü-foszfokolin) a szubakut toxicitás erősen szignifikáns növekedéséhez vezet. Farmakológia! vizsgálati eredmények A Összefoglalás Egy tetrazóliumsó (MIT) bíborszínű formazánná történő intracelluláris redukciója a sejt életképességének az indikátora. A MIT-teszt a citotoxicitás meghatározásához egyszerű kolorimetriás eljárás. Leírásunkban új módszert adunk meg a formazánkristályok feloldására, ami a próbát gyorsabbá és reprodukálhatóbbá teszi. A különböző sejtvonalaknál megfigyelhető eltérő formazánképződési kinetika egyedi kalibrációs görbék készítését teszi szükségessé. Az oxazafoszforinokkal szemben rezisztens és szenzitív sejtek közötti nyilvánvaló különbség arra utal, hogy a próba hatóanyagokkal szembeni in vivo érzékenység predikciójára alkalmas. Anyag és módszer A KB-sejtek laphámrák eredetű humán sejtvonalnak felelnek meg, amelyek szövettenyészetben tarthatók fenn. A 3-(4,5-dimetü-tiazol-2-ü)-2,5-difenü-tetrazólium-bromidot (MIT, Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen) foszfát puff eres sóoldatban (PBS; Seromed, Berlin) oldjuk 5 mg/ml végkoncentrációban, és steril szűrés után (MUlipore 0,2 pm) alikvot részeit -20 °C- on lefagyasztjuk későbbi felhasználáshoz. A 0,04 n HCl/izopropanol elegyet laboratóriumi minőségű reagensekből állítjuk elő. A KB-sejtek szuszpenzióját tápfolyadékkal kívánt sűrűségűre állítjuk be. Hozzáadjuk a vizsgálandó vegyületet és minden további hígítást ebből a mintából állítunk elő, hígító folyadékként a beállított sejtszusz - penziót használva. Mikrotiter lemezek (Falcon 3072) furataiba 100 pl vegyület/sejtszuszpenzió keveréket töltünk, majd a lemezeket 37 °C-on 95% relatív páratartalommal 5-10% C02 - levegő atmoszférában inkubáljuk. A minták értékelése előtt 4 órával 10 pl MIT-oldatot adunka furatokhoz, majdaz inkubálást továbbfolytatva a MIT formazánkristályokká alakul át. Végül minden furathoz 100 pl HCl/izopropanol elegyet adunk. Ezután a lemezeket ultrahangos fürdő (Bandelin-Sonorex, RK510H típus, 35 kHz, 225/450 Watt) felszínén hagyjuk úszni 1-2 percen át Előkísér letekben meghatároztuk a vízszint optimális magasságát, hogy elkerüljük a múlták kiömlését. A kristályok tökéletes feloldódása után a lemezeket mikrotiter-leolvasó készülékben értékeljük (Dynatech 11R600, vizsgálati hullámhossz: 540 nm, referencia hullámhossz 630 nm). Minden vizsgálandó anyaggal 24 órás próbát végzünk, miközben a mintákat folyamatosan tesszük ki a szer hatásának. Egyik értékelési kritérium az EC50 érték kiszámítása (az optikai elnyelést 50%-kal csökkentő hatásos koncentráció). Ezt regressziós analízissel számítjuk ki és %-os gátlás formájában fejezzük ki, a megfelelő kontrolihoz való viszonyítás alapján. Az IC50 értékeket 24 órai inkubálás után a MIT- teszt segítségével határozzuk meg Mosmann leírása szerint (Mosmann T„ J. Immunol. Methods 65, 55 (1983). Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza: Lánchossz IC50 pg/ml 24 h C-16(D 18506) Hexadecü-foszfokolin 5,32 C-18(D 19391) Oktadecü-foszfokolin 13,1 Mint látható, a hexadecil-foszfokolin (D 18506) IC50 értéke jelentősen alacsonyabb az oktadecü-foszfokolinénál. Ez az észlelés meglepő, mivel a hexadecü-foszfokolin specifikus hatását támasztja alá, amely rövidebb, illetve hosszabb szénláncok esetén ismét elvész. B Ha egy foszfolipidet a találmány szerint alkil-glicerinéterrel kombinálunk, a hatás nem azon alapul, hogy a hatóanyag (a foszfolipid) jobban behatol a szövetmembránba, hanem meglepő, valódi szinergista hatásról van szó, aminek nincs köze a jobb penetrációhoz. Ezt a kísérleti eredmények egyértelműen igazolják. E kísérleti eredmények szerint a hexadecil-foszfokolin foszfolipid önmagában, a glicerinéter-keverék önmagában, valamint a foszfolipid (hexadecü-foszfokolin) és a glicerinéter-keverék kombinációja citotoxikus hatású. Ennél az in vitro kísérletnél a szervezet szövetmembránjain való áthatolás nem jön tekintetbe, hanem a daganat-sejtekre gyakorolt közvetlen hatásról van szó. Ha nem állna fenn szinergizmus - ami mint olyan egyedül igazolja a kapott eredményt -, találmányunk a következő okból sem lenne nyilvánvaló. Eibl és munkatársai közleménye kizárólag a vér-agy gáton való tökéletesebb hatóanyag-penetrációra vonatkozik. Ezzel szemben találmányunknál mindenekelőtt nem a vér-agy gáton való áthatolásról van szó, hanem arról, hogy foszfolipidek és glicerinéterek kombinációja például helyüeg is, azaz az emberi szervezet felhámján, illetve más szövetmembránjain keresztül jut el a daganat helyére. így a vér-agy gáton való áthatoláskor egy anyagnak az agy hajszálerem, azaz a megfelelő belhámon, az endotélen kell átjutnia. Ellentétben más hajszálér-területek endotéljével, az agyi hajszálereknél hiányoznak a nagyobb nyüások (ablakok), amelyek lehetővé teszik 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
