203103. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4,5-dihidro- és 4,5,6,7-tetrahidropirazolo-[1,5-a]-pirimidin-származékok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
5 HU 203 103 B 6 I. táblázat A találmány szerinti vegyületek védőhatása a patkányokon pentiléntetrazollal kiváltott klonikus görcsökkel szemben A vegyület Dózis A védett mg/kg patkányok %-os aránya 4,5-Dihidro-7-[3-(trifluor-metil)-fenil]pirazolo[ 1,5-a]pirimidin-3- -karbonitril 25 100 50 4,5-Dihidro-7-fenil-pirazolo[l,5-a] 25 pirimidin-3-karbonsavamid 50 4^-Dihidro-7-[3-(trifluor-metil)-fenil]pirazolo[ l,5-a]pirimidin-3- -il]-fenil-metanon 25 75 A szorongásoldó hatás kiértékelésére alkalmazható, további vizsgálati módszer a nem kondiciált, passzív elhárítási válasz vizsgálata [J. R. Vogel és munkatársai: Psychopharmacologya, 21,1 (1971)]. E módszer módosításával patkányokon konfliktushelyzetet idéztünk elő, s így vizsgáltunk. 8 db 200-240 g testtömegű, Wistar-törzsű, hím patkányból álló csoportokat 48 órán át szomjaztattunk. A vizsgálati vegyületeket orálisan, egyszeri vagy több dózisban adagoltunk; a vegyületeket 2% keményítőt, 5% polietilénglikolt és 1 csepp polysorbate 80 felületaktív szert tartalmazó desztillált vízben oldottuk. A kontrollállatoknak csak vivőanyagot adagoltunk. Az adagolás után 60 perccel a patkányokat egyenként átlátszó, műanyagból készült rekeszekbe helyeztük. Az állatoknak a víz ad libitum rendelkezésére állt a főrekesszel érintkező, fekete dobozban elhelyezett tartóban. A rozsdamentes acélból készült rekeszrács és a víztartó között 0,7 milliamperes sokkoló váltóáramot vezettünk át. Miután az állatok 20-szor megízlelték a vizet, 2 másodperces sokkoló áramot vezettünk a patkányon át így 20, sokkolás nélküli ivást mindig követett egy 2 másodpercen át tartó áramütés, összesen 3 percig. A 3 perces időtartam során az 1-1 patkány által fogadott áramütések számát feljegyeztük, és összehasonlítottuk a kontrollcsoporttal. A vizsgálati vegyületeket akkor tekintettük hatásosnak, ha a vizsgálati állatcsoportban az eltűrt áramütések száma jelentősen meghaladta a kontrollcsoportban eltűrt áramütések számát (a Mann-Whitney „LT próba alapján értékeltük a szignifikánciát); azaz a vizsgálati vegyületeket akkor tekintettük aktívnak, ha valamivel több, mint kétszeres mennyiségben tűrték az áramütéseket a kezeletlen patkányokhoz viszonyítva. Egy reprezentatív találmány szerinti vegyUlcttel ebben az in vivo kísérletben kapott eredményeinket a II. táblázatban foglaltuk össze. II. táblázat A konfliktushelyzet vizsgálata patkányokon A vizsgálati vegyület Adag Eredmény (az mg/kg áramütések száma 3 percenként) (4,5-Dihidro-7-[-3-(trifluor- 25 19,1 -metil)-fenil] -pirazolo[ 1,5-a] pirimidin-3-il J -fenil-metanon II. táblázat folytatása A vizsgálati vegyület Adag Eredmény (az mg/kg áramütések száma 3 percenként) 4,5-Dihidro-4-metil-7-[3-(trifluor-metil)-fenil]-pirazolo[l,5-a] pirimidin-3-karbonitril 25 19,0 A szorongásoldó hatás meghatározására további vizsgálatként azt a módszert alkalmaztuk, amelynek során mértük a vizsgálati vegytíletnek a gátló képességét triciált benzodiazepin-származékoknak emlősök specifikus agyi receptoraihoz való kötődésére. E célra R. F. Squires és munkatársai [Nature, 266,732 (1977)] valamint H. Mohler és munkatársai [Science, 198, 849 (1977)] módosított módszerét alkalmaztuk. E vizsgálatainkban 150-200 g testtömegű, Wistartörzsű, hím albínópatkányokat alkalmaztunk. A vizsgálati vegyületeket dimetil-formamidban, ecetsavban, etanolban vagy sósavban oldottuk. Patkányok teljes agykérgét enyhén homogenizáltuk 20-szoros térfogatú, jéghideg 0,32 M szacharózoldatban, kétszer centrifugáltuk 10 percig 1000 x g sebességgel, majd ismételten centrifugáltuk 20 percig 30 000 x g sebességgel, s így nyers P2-szinaptoszomális frakciót kaptunk. Ezt a P2 frakciót úgy dolgoztuk fel tovább, hogy: (1) reszuszpendáltuk az eredeti térfogat kétszeresében vett, hipotóniás 50 mMTris. HCl-ben (pH 7,4), vagy (2) reszuszpendáltuk az eredeti térfogat felében vett hipotóniás 10 mM Tris-HG-ben (pH 7,4) és a felhasználás időpontjáig lefagyasztottuk (-20 *C-on). A mérés időpontjában a fagyasztott P2 készítményeket felolvasztottuk, & az eredeti homogenizáló térfogat négyszeresében szuszpendáltuk. A kötődési vizsgálatot 300 pl P2-frakció szuszpenzióval (megfelel 0,2-0,4 mg fehérjének), 100 pl vizsgálati hatóanyaggal és 100 pl 3H-diazepam-mal (1,5 nM végkoncentráció) vagy 3H-flunitrazepam-mal (1,0 nM végkoncentráció) végeztük, amelyeket 1,5 ml 50 nM Tris- HCl-hez (pH 7,4) adtunk. A nem specifikus kötődés kontrollját és a teljes kötődés kontrollját úgy végeztük, hogy a vizsgálati vegyület helyett 100 pl diazepam-ot (3 pM végkoncentráció), illetve 100 pl ionmentesített vizet alkalmaztunk. Az inkubálást 30 percig végeztük jéghűtéssel, majd üvegrostszűrőn vákuumszűréssel fejeztük be. A szűrőket kétszer mostuk 5 ml jéghideg 50 mM Tris. Hcl-vel (pH 7,4), és szcintiUációs fiolákba helyeztük. 50-60 'C-on 30 percig tartó szárítás után 10 ml hígítószelt adtunk hozzá, és a radioaktivitást szcintillációs számlálóban meghatároztuk. A kötődés gátlását úgy számítottuk ki, hogy a teljes kötődés és a vizsgálati vegyület jelenlétében megfigyelt kötődés különbségét osztottuk a teljes kötődéssel, és az így kapott mennyiséget 100-zal szoroztuk. Fiziológiai hatás várható olyan vizsgálati vegyülettől, amely a 3H-benzodiazepin-származék kötődését 12%kal vagy ennél erősebben gátolja. Ez az in vitro hatás biológiai szempontból akkor lényeges, ha a vizsgálati vegyület statisztikai szempontból szignifikáns szorongásoldó hatást is kifejt az in vivo vizsgálatokban. A fenti in vitro vizsgálat egyes találmány szerinti 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
