203087. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cikloalkil-tiazol-származékok és az e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
5 HU 203 087 B 6 Az (I) általános képletű vegyületek és az R helyén hidrogénatomot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek sói a hörgösszehúzódás inhibitorai és ezért bronchopulmonáris szerként alkalmazhatók, pl. asztma és allergiás reakciók enyhítésére. Az (I) általános képlett! vegyületek fenti hatását az alábbi tesztekkel igazoljuk. Leukotrién-DA-receptoron megkötő vizsgálat (tengerimalactüdő-homogenizátum) 1. Vizsgálati módszer a) Membrán-homogenizátum elkészítése Hím albino tengerimalacokat (Hartley-törzs, testtömeg 400-500 g) lefejezéssel megölünk. Az állatok tüdejét eltávolítjuk, folyékony nitrogénben megfagyasztjuk és felhasználásig -70 *C-on tároljuk. A fagyasztott szövetet (5 g) felengedjük, kis darabkákra vágjuk és foszfáttal pufferolt nátrium-klorid-oldattal öblítjük. A szövetet 40 ml homogenizációs pufferbe helyezzük, amely 0,25 mól szacharózt, 10 millimól trisz-HCl-t (pH 7,5) és az alábbi proteáz-inhibitorokat tartalmazza: szójabab-tripszin-inhibitor (5 pg/ml), bacitracin (100 pg/ml), benzamidin 10~3 mól) és fenil-metil-szulfonil-fluorid (K^4 mól). A proteáz-inhibitorokat azért adjuk hozzá, hogy a homogenizálás és centrifugálás műveletei alatt a proteolízist meggátolják. A szöveteket 0-4 *C-on Brinkman PT-20 politron segítségével, öszszesen egy percen át homogenizáljuk (10 mp-es időtartamokon át, közben 6 alkalommal ülepedni hagyjuk). A homogenizátumot a szövetdarabkák, feltöretlen sejtek és sejtmagok eltávolítása céljából centrifugáljuk (1000 g, 10 percen át). A felülúszót 30 000 g mellett 30 percen keresztül újracentrifugálva pelletet nyerünk, amelyet a továbbiakban „nyers membránfrakciók”-nak nevezünk. Ezt a frakciót az inkubációs pufferben (10 millimól Pipes puffer, pH 7,5,50 millimól nátrium-klorid) újraszuszpendáljuk, Teflon-homogenizátorban homogenizáljuk és 30 000 g mellett 30 percen át újracentrifugáljuk. A pelleteket az inkubációs pufferben Teflon-homogenizátorban újraszuszpendáljuk; a szuszpenziót fehéijekoncentrációja 10-20 mg/ml. A fehérje-koncentrációt Biorad reakció-kit segítségével határozzuk meg. b) Receptor-ligand megkötési teszt Az optimális vizsgálati körülményeket alábbi összetételű vizsgálati keverékekkel határozzuk meg: Tyroda oldat; 0,1% szarvasmarha-szérumalbumin (BSA); 1 millimól glicin; 1 millimól cisztein; 3,5 nmól 3H-LTD4 és a membrán-készítmény (100-200 pg fehérje), 250 pl végső térfogatban. Az inkubálást 20 *C-on 30 percen át végezzük. A megkötés 20 *C-on a fehéijekoncentrációval lineárisan emelkedik, 20 perc után egyen- 5 súlyt ér el, telíthető és jelzetlen LTD4 hozzáadásakor reverzibilis. A megkötött és szabad 3H-LTD4-t oly módon választjuk el egymástól, hogy GF/C üvegszálas szűrőn gyorsan leszűrjük és 0,1% BSA-t tartalmazó Tyrode-oldat 4 ml-es aliquot részeivel kétszer mossuk. 10 A szűrőn maradó radioaktivitást 10 ml Aquasolban mérjük. Fajlagos megkötésnek a 10“6 mól jelzetlen LTD4 által kiszorított értéket tekintjük és ez a teljes megkötés 95%-a. 15 Leukotrién által előidézett hörgösszehúzódás meghatározása tengerimalacon - in vivo leukotrién DA (LTD) antagomsta teszt 20 Intravénás és orális teszt Hím tengerimalacokat (Hartley-törzs Charley River, testtömeg 300-500 g) metánnal (kb. 2g/kg, i.p.) intraperitoneálisan érzéstelenítünk és a teszt-vegyület intravénás beadása céljából a véna jugulárisba polietilén-kandit 25 illesztünk. A tracheális nyomást (H20 cm) Stathamnyomás-transzducerrel (P 32 AA) feljegyezzük. Az LTD-reakció kiváltása előtt 5 perccel propranololt adagolunk be. A spontán légzést 2 perc múlva szukcinil-kolin-klorid (1,2 mg/g) intravénás beadásával leállítjuk. Az álla- 30 tokát Harvard-féle (680 modell) kis állatlélegeztető készülék segítségével lélegeztetjük; percenként 40 lélegeztetés, 4,0 ml-es lökettérfogat A kontroll hordozóanyagot illetve a tesztvegyület, a kanülön keresztül juttatjuk a véna jugulárisba, majd egy perc múlva az álla- 35 tokon 25 pg/kg maximális összehúzódást előidéző LTD- dózis intravénás beadásával hörgösszehúzódást idézünk elő. Az átlagos tracheális nyomásváltozást a kontroll és kezelt csoportban meghatározzuk és a százalékos gátlást kiszámítjuk. Az orális aktivitás meghatározása céljából 40 a teszt-vegyületet vagy a hordozóanyagot az LTD-reakció kiváltása (25 pg/kg i.v.) előtt két (kával adjuk be. Az intravénásán és orálisan adagolt tesztvegyület realtív hatékonyságát (ID» értékek) a teszt-vegyület növekedő dízisainak beadásával határozzuk meg. 45 Az egyes tesztvegyületek hatás-időtartalmának meghatározása céljából változtatjuk a tesztvegyület beadása és az LTD-reakció előidézése között eltelt időt. Az aktivitás időtartamának azt az időt tekintjük, amikor a gátlás 40%-ra csökkent. 50 I. táblázat Tesztvegyület LTD4-megkötés IC50 (pmól) %-os gádás 1 mg/kg i.v.dózisnál (ID50) LTD4 által előidézett hörgösszehúzódás %-os gátlása, 10 mg/kg p.o. orális dózisnál (IDso) Időtartam 10 mg/kg- P-o. 4 óra 8 óra 18 óra (E)-4-[ {3-[2-/(-ciklopropil-2-tiazolil)-etenil]-fenil) - -amino]-2,2^iietil-4-oxo-butánsav 0,020 94±2 (0,18) 98±1 (1,1) 99±1 95+1 61±6 4
