202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 tűk az E’-Spl sejtekkel 30 1A2 sejt/E’SpI sejt arányban. A sejtkeveréket 10 laposfenekű, 96 üreges mikrotitráló lemezre helyeztük 155 000 sejt/üreg koncentrációban 200 pl/üreg térfogatban, és a tenyészetet 37 °C hómérsékleten inkubáltuk 6% CC>2-t tartalmazó nedvesített atmoszférában. A tenyészeteket minden harmadik-negyedik napon tápláltuk, a felülúszó felét friss HAT tápközeggel helyettesítve. Az üregeket minden második napon megfigyeltük fordított mikroszkópon a sejtek burjánzásának jeleit keresve. Két héttel azután, hogy a sejteket a lemezre helyeztük, és azután, hogy az 1A2 sejtek a HAT szelekció következtében elhaltak, az üregek táplálását egy új összetételű tápközeggel hajtottuk végre, amely csaknem azonos volt a HAT tápközeggel, azzal a különbséggel, hogy az aminopterin komponens hiányzott belőle. 18 nappal a lemezre helyezés után megfigyeltük, hogy az üregek mintegy 70%-a tartalmazott burjánzó sejteket és hogy az üregek többségében a sejtek megfelelő sűrűségűek voltak az eltávolításhoz és a felülúszó vizsgálatához anti-P. aeruginosa antitestre. C. A fajlagos antitestet kiválasztó sejtek kimutatása. A felülúszókat egy enzimmel kötött immunoszorbens mérési technikát (ELISA) alkalmazva vizsgáltuk át anti-P. aeruginosa antitestekre (Engvall, E.: Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology/ Mennyiségi enzim-immunmeghatározás (ELISA) a mikrobiológiában), Med. Biol. (1977), 55, 193— 200. Az antigén-lemezek 96 üreges, laposfenekű mikrotitráló lemezekből álltak, amelyeknek üregei különböző teljes baktériumokat tartalmaztak, amelyeket előzőleg etanollal rögzítettünk az üregek fenekére. A lemezeket 50 pl PBS-ben levő mosott baktériumszuszpenzió [OD (optikai sűrűség)660-0,2] üregekbe beadásával, a lemezek 20 percen át 500 xg-vel centrifugálásával, a PBS leszívásával, 75 pl etanol 10 percen át történő hozzáadásával, az etanol eltávolításával és végül levegőn szárítással készítettük elő. Az átvizsgálásban használt különböző antigén-lemezek a következők voltak: 1. P. aeruginosa, Fisher-féle 1-3. immun-típusok (ATCC 27312, 27313, 27314) keveréke; 2. P. aeruginosa, Fisher-féle 4-7. immun-típusok (ATCC 27315, 27316, 27317, 27318) keveréke; 3. Escherichia coli egy klinikai izolátuma; 4. Klebsiella pneumoniae (ATCC 8047); és 5. mikrotitráló lemez baktérium nélkül. Az ELISA eljáráshoz az antigén-lemezek üregeit először lezártuk 75 pl 5%-os BSA-val 1 órán át, hogy megakadályozzuk a fehérje nem fajlagos kötését. Miután a nem adszorbeált BSA-t eltávolítottuk, a tenyésztő lemez üregeiből a felülúszókat pontos sorrendben helyeztük el az antigén-lemezek megfelelő üregeibe (50 pl/üreg, és a lemezeket egy nedvesített kamrában 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk 30 percen át. A felülúszókat ezután eltávolítottuk, az üregeket háromszor mostuk 1%-os BSA-PBS-sel, és 50 pl biotinezett kecske anti-humán immunglobulint (lg) Tago 2593 szám, 1:10000 arányban hígítva 1%-os BSAPBS-sel) adtunk minden egyes üreghez. 30 perces inkubálás után 37 °C hőmérsékleten nedvesített kamrában, a biotinezett anti-humán Ig-t eltávolítottuk, az üregeket háromszor mostuk 1%-os BSA-PBS-sel, és 50 pl előre elkészített avidin: biotinezett torma- peroxidáz komplexet (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Kalifornia) adtunk minden egyes üreghez. 30 perces, szobahőmérsékleten történő inkubálás után a Vectastain ABC reagens fölöslegét eltávolítottuk, az üregeket ismét mostuk háromszor 1%-os BSA-PBS-sel, és 100 pl szubsztrátumot [0,8 mg/ml ortofenilén-diamin dihidroklorid 100 mmól/literes citrát-pufferban, (pH 5,0), plusz 0,03% H2O2 ionmentesített H2Ű-ban, egyenlő térfogatban összekeverve éppen a lemezre helyezés előtt] adtunk minden egyes üreghez. 30 perces, sötétben végzett inkubálás után 50 pl 3 n H2SC>4-et adtunk minden egyes üreghez a reakció leállítása érdekében. A lemez antigénjének megfelelő antitesteket tartalmazó tenyészet-felülúszókat pozitív színkifejlődés alapján mutattuk ki a megfelelő üregekben és a reakcióerősséget mennyiségileg a 490 nm-nél mért abszorpcióval, Dynatech MR 580 mikro-ELISA leolvasón mértük. A fenti módszerrel a tenyészet-felülúszók elemzése három olyan üreg azonosításához vezetett (6F11, 4G9 és 10B2), amelyek tartalmaztak anti-P. aeruginosa fajlagosságot Fisher-féle 1-3. immun-típust tartalmazó lemezen, de nem tartalmazták ugyanezt Fisher-féle 4- 7. immun-típust tartalmazó lemezen, vagy a kontroll lemezek bármelyikén. Abból a célból, hogy' a felismert fajlagos Fisher-féle immun-típust azonosítsuk, csupán egy Fisher-féle immun-típushoz tartozó etanollal rögzített baktériumokat tartalmazó lemezeket készítettünk a fent leírt módon minden egyes immun-típushoz. Az ELISA vizsgálat kivitelezése a fent leírt módon a 6F11, 4G9 és 10B2 üregek tenyészet-felülúszóival az egyes immun-típusoknak megfelelő lemezeken jelezte, hogy ez a három üreg Fisher-féle 2. immuntípusra fajlagos antitesteket tartalmazott. D. Fajlagos antitesteket termelő sejtek klónozása A 6F11, 4G9 és 10B2 üregekben levő sejteket számos (két vagy három) klónozási menetnek vetettük alá, amíg a fenti ELISA eljárással mért összes klónfelülúszó a Fisher-féle 2. immun- típust tartalmazó antigén-lemezeken pozitív reakciót adott. A sejteket emberi fityma fíbroblaszt félig összefolyó rétegén történő korlátozott hígítással klónoztuk laposfenekű, 96 üreget tartalmazó lemezeken. A tápközeg RPMI 1640 alapon 15% (térf/térf.) FCS-t, 2 mmól/1 L-glutamint, 1 mmól/1 nátrium- piruvátot, 100 nemzetközi egység/ml penicillint, és 100 pg/ml sztreptomicint tartalmazott. A tenyészeteket minden 3. napon tápláltuk a felülúszó felének kicserélésével friss tápkőzeggel. Általában az üregek a megfelelő limfoblasztoid-sejt sűrűséget az anti-Fisher-féle 2. immun-típus fajlagosság elemzéséhez a lemezre helyezéstől számítva a 2. és 3. hét között érték el. így ebben a kísérletben három klónozott, transzformáit emberi sejtvonalat nyertünk, amelyek folyamatosak (nem pusztulók) voltak, és amelyek mindegyike 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 t 6a 6
