202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 humán monoklonális antitesteket választott ki a Fisher-féle 2 immun-típusú P. aeruginosa LPS molekuláin levő szerotípusos determinánsok ellen. Ebben és a következő példákban a sejtvonalak és az antitestek, amelyeket termelnek, ugyanezeket a jelöléseket viselik. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt a folyamatos transzformált humán sejtvonalat, amelyeket itt 6F 11-nek jelöltünk, elhelyeztük az Amerikai Fajtatenyészet Gyűjteményben (ATCC), Rockville, Maryland, ATCC CRL 8562 számon. Az a tény, hogy a kiónok mindegyikéből származó monoklonális antitestek kizárólag egy egyedi (jelen esetben Fisher-féle 2.) immun-típussal reagáltak, azt sugallta, hogy az antitest közvetlenül egy lipopoliszacharid antigén ellen irányul. Mivel az LPS szerotípus összefüggésben van a Fisher-féle immun-tipizálási renszerrel [Hanessian: Nature (New Biology) (1971), 229, 209-210]. Ezt tovább vizsgálandó, kiterjesztett ELISA vizsgálatot hajtottunk végre a 6F11, 4G9 és 10B2 felülúszókkal teljes, rögzített baktériumokat tartalmazó lemezeken, amelyek a P. aeruginosa ATCC 33348-33364, P. aureofaciens, E. coli 0111: B4- nek J5 mutánsa és Providentia stuartiinak egy klinikai izolátuma tizenhét IATS szerotípusú törzseit tartalmazták. A Fisher-féle immun-típusoknak és megfelelő LPS-re alapozott szerotípusainak az IATS-sémában végzett összehasonlításával teljes összhangban (lásd 1. táblázat) az anti-Fisher-féle 2. immun-típusú klón felülúszók csak az IATS-féle 11. törzzsel léptek reakcióba. Reakciót egyáltalán nem figyeltünk meg a nem P. aeruginosa baktériumok egyikével sem. A három anti-Fisher-féle 2. immun-típusú monoklonális antitest egyikét tovább jellemeztük. Az ELISA- mérésekben az antitestek erősebb reakciókészségére és a megfelelő sejtvonal jobb növekedési tulajdonságaira alapozva a 6F11 monoklónt választottuk. A 6F11 antitest által felismert molekulafajták biokémiai jellemzését immun-folt elemzéssel hajtottuk végre. Röviden: 20 pg nyers LPS-t (Westphal, O. és munkatársai: Über die Extaktion von Bakterien mit Phenol/Wasser/ A baktériumokból történő extrakció fenol/vízzel), Z. Naturforsch. (1952), 79, 148-155) a hét Fisher-féle immun-típus mindegyikéből, 20 pg kromatográfiával tisztított LPS-t E. coli 0111: B4-ből és Klebsiella pneumoniae-ből (mindkettő a List Laboratories, Campbell, Kalifornia, gyártmánya), és 50 pg, Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumból származó külső membrán-készítményt (Tamm, M. R. és munkatársai: Serological Classification of Neisseria gonorrheae With Monoclonal Antibodies/ A Neisseria gonorrheae szerológiai osztályozása monoklonális antitestekkel), Infect. Immun. (1982), 36, 1042-1053 egyenként nátrium-dodecil-szulfát (SDS)- poliakrilamid gélelektroforézisnek vetettünk alá (Hancock, R.E.W. és Carey, A.M.: Outer Membrane of Pseudomonas aeruginosa: Heat and 2-mercapto-ethanol-Modifiable Proteins/ A Pseudomonas aeruginosa külső membránja: hővel és 2-merkapto-etanollal módosítható fehérjék), J. Baderiol. (1977), 140, 901-910. Az elkülönített molekulafajtákat a gélről nitrocellulóz membránra (NCM) vittük át, amint ezt másutt leírták (Towbin, H. és munkatársai: Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications/ Fehérjék elektroforetikus átvitele poliakrilamid gélekről nitrocellulóz lapokra: Eljárás és néhány alkalmazási terület), Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1979), 76, 435(M354 és az NCM foltot 1 órán át blokkoltuk PBS-Tweenben [Batteiger, B. és munkatársai: The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins Transferred to Nitrocellulose Membranes (Tween 20, mint blokkolószer alkalmazása a nitrocellulóz membránokra átvitt fehérjék immunológiai kimutatásában). J. Immunoi Meth. (1982), 55, 297-307]. A foltot azután 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk 30 ml PBS- Tweenben, amely 3 ml, 6F11 vonalból származó használt tenyészet- felülúszót tartalmazott. Négyszer végzett 5 perces öblítés után PBS-Tween-ben a foltot 1:5000 hígítású (PBS-Tweenben) nyúl-anti- humán Igben inkubáltuk 1 órán át szobahőmérsékleten. A foltot négyszer PBS-Tween-nel öblítettük, majd 30 ml, 1:2000 hígítású (PBS-Tweenben) torma-peroxidáz A- fehérjét tartalmazó oldatban (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, Kalifornia) helyeztük. Egy órás inkubálás után szobahőmérsékleten a foltot négyszer átöblítettük PBS-Tweenben, majd 60 ml szubsztrátumba merítettük, amelyet a következőképpen készítettünk. 120 mg torma-peroxidáz színkifejlesztő reagenst (Bio- Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) feloldottunk 40 ml hideg metanolban; 120 pl 30%-os H202-t adtunk hozzá 200 ml Tris-sel pufferolt sóoldatban (TBS - 20 mmól/1 Tris, pH 7,4, 0,5 mól/1 NaCl); a két oldatot közvetlenül csak a folthoz adás előtt kevertük össze. Miután a megfelelő szín kifejlődése megtörtént (általában 15-45 perccel a szubsztrátum hozzáadása után), a reakciót lefojtottuk, a foltot több alkalommal ionmentesített vízzel átöblítve. Az eredmények a következők voltak. Pozitív reakciókat csak azokban a nyomokban jegyezhettünk fel, amelyek Fisher-féle 2. immun-típusú nyers LPS-t és Fisher-féle 2. immun-típusú baktériumokból származó külső membrán készítményt tartalmaztak. Ezeknek a nyomoknak mindegyikében a 6F11 antitestről kitűnt, hogy felismeri a szabályosan elhelyezett molekuláris tulajdonságok egy egész sorát, egy létra-szerű mintát alakítva ki. Ez a profil teljesen egybevág azzal^amely az LPS poliliakrilamid-gél elektroforézis-elemzésében látható SDS jelenlétében, ahol azt mutatták k»y hogy a csíkok által mutatott heterogén méret-profil az LPS molekulák sokaságának tulajdonítható; ezek a súlynövekedésben különböznek, amelyek viszont a molekulánként jelenlévő O-antigén oligoszacharid-oldallánc egységek számának felelnek meg. [Pavla, E.T. és Makela, P.H.: Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) A lipopoliszacharidok heterogén volta Salmonella typhimuriumban, nátrium-dodecil-szulfát (poliakrilamid-gél elektroforézissel elemezve), Eur. J. Biochem., (1980), 107, 137-143; és Goldman, R.D. és Leive, L.: Hete-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
