202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 LATS (szerotípus) Fisher (immun-típus) 5 3,7 6 1 7 6 8 6 9 — 10 5 11 2 12 — 13 — 14 — 15-16 3,7 17-A monoklonális antitesteket a megfelelő gram-negatív baktérium fertőzésének jelenleg vagy valamikor kitett humán donorokból nyert B limfocita-sejtek Epstein-Bair vírussal (EBV) történő sejttel hajtott transzformációjával állítjuk elő. Az így nyert antitest-kiválasztó sejtvonalakat úgy lehet jellemezni, mint folytonosan növekvő limfoblasztoid sejteket, amelyeknek diploid kariotípusa van, Epstein-Barr központi antigén (EBNA) pozitívak, és IgG, IgM, IgA vagy IgD izotípusok valamelyikének, beleértve az IgGl, IgG2, IgG3 és IgG4-altípusokat is, monoklonális antitestjeit választják ki. A sejttel hajtott transzformációs folymat maga M.E. Lostrom találmánya, és részletesen a 4 464 465 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban van leírva, amely referenciaként van beépítve ebbe a bejelentésbe. A monoklonális antitesteket használhatjuk sértetlen (teljes) formában, vagy fragmensek formájában, mint pl. Fab vagy F(ab’)2, általában inkább érintetlen formában. Bizonyos esetekben kívánatos lehet az antitesteket összekapcsolni más anyagokkal a megfelelő eredmény elérése érdekében, így pl. az antitesteket össze lehet kapcsolni citotoxikus szerekkel, mint pl. radionukleidekkel, antibiotikumokkal, stb. Ennek a folyamatnak az alkalmazását a jelen monoklonális antitestek előállítására az ezután következő példák mutatják be. Ezek a példák csupán a találmány egyes kiviteli módjait kívánják illusztrálni, és nem úgy vannak összeállítva, hogy a találmány oltalmi körét korlátozzák. 1. példa Az 1. példa módszereket mutat be Fisher-féle 2. immun-típusú (11. IATS típusú) P. aeruginosa LPS molekulák elleni humán monoklonális antitestek előállítására, továbbá bemutatja az említett antitest védő aktivitását in vivo egy homológ törzs letális támadása ellen. A. A megfelelő emberi sejt kinyerése. A megfelelő humán B-sejtek (limfociták) egy meghalt egyén lépéből származtak, akiről ismert volt, hogy epehólyag-fibrózis betegségben szenvedett és korábban P. aeruginosa-val volt fertőzve. A lépet, amelyet autopsziával nyertünk ki, kb. 15 mm vastag szeletekre vágtuk. A sejteket megszabadítottuk a toktól és a sejtközötti állománytól egy nagy petri-csészében, enyhén átitatva az egyes szeleteket kalcium- és magnéziummentes foszfáttal pufferolt sóoldattal (CMF-PBS), amelyet egy fecskendőhöz rögzített 18. méretű tón keresztül adtunk be. Egymagvú sejteket különítettünk el a lépsejt-készítményből standard centrifugálási technikával Ficoll-Paque alkalmazásával [Bogum, A.: Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood (Egymagvú sejtek és granulociták izolálása emberi vérből). Scand. J. Clin. Lab. Invest. (1968), 21, 97. melléklet, 77-89], és kétszer mostuk CMF-PBS- ben. Az egymagvú sejtek körül T-sejteket egy módosított E-rozettázási eljárást alkalmazva. Röviden, a sejteket először újra szuszpendáltuk MO7 sejt/ml koncentráicóra 20% borjú embrió-szérumot (FCS) tartalmazó PBS-ben 4 ‘C hőmérsékleten. Ennek a szuszpenziónak 1 ml-ét azután egy 17*100 mm-es kerekfenekű polisztirol-csőbe helyeztük, amelyhez MO9, 2-aminoetil-izotiouronium-bromiddal (AET) kezelt birka vörösvérsejtet adtunk 10%-os (térfVtérf.) RPMI 1640 tápközeggel képzett oldatból (Madsen, M. és Johnson, H.E.: A Methodological Study of E-rosette formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells/ Módszertani tanulmányok E-rozetta képzéssel kapcsolatban, AET-vel kezelt birka vörösvértesteket alkalmazva), J. Immun. Methods (1979) 27, 61-74. A szuszpenziót enyhén kevertük 5-10 percen át 4 "C hőmérsékleten és az E-rozettázott sejteket azután centrifugálással eltávolítottuk Ficoll-Paque alkalmazásával 8 percen át 2500 xg-vel 4 °C hőmérsékleten. Az E-rozettázásra negatív lép-eredetű egymagvú sejteket (E ’Spl), amelyek az érintkező felülethez voltak kötve, egyszer mostuk RPMI 1640 tápközeggel és ugyanebben újra szuszpendáltuk, de ez tartalmazott 15% (tériVtérf.) FCS-t, 2 mmól/1 L-glutamint, 1 mmól/1 nátrium- piruvátot, 100 nemzetközi egység/ml penicillint, 100 g/ml sztreptomocint, 1*10' mól/1 hipoxantint, 4*10‘7 mól/1 aminopterint és 1,6*10'5 mól/1 timidint is. Ezt a tápközeget a továbbiakban HAT tápközegnek nevezzük. B. A sejtek sejttel hajtott transzformálása. Az E'SpI sejtek sejttel hajtott transzformálását E" Spl sejteknek egy transzformáló sejtvonallal együtt történő tenyésztésével hajtottuk végre. A transzformáló sejtvonal egy Epstein-Barr központi antigén (EBNA) pozitív humán limfoblasztoid sejtvonal volt, amely a GM 1500 limfoblasztoid sejtvonal etil-metánszulfonátos (EMS) mutageneziséből, majd ezt követő 30 pg/ml 6-tioguanin jelenlétében történő szelekciójából származott, a 6-tioguanidinos szelekció a sejteket hipoxantinguanin foszforibozil transzferáz (HGPRT) hiányosság és így HAT-érzékennyé tette. Ezt a sejtvonalat neveztük 1A2 sejtvonalnak és 1982. márc. 29-én letétbe helyeztük azt ATCC- nél, ATCC CRL 8119 számon. Logaritmikus növekedési fázisban levő 1A2 sejteket szuszpendáltunk HAT tápközegben, majd összekever-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
