202927. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán monoklonális antitestek előállítására gram-negatív baktériumok szerotípusos lipopoliszacharid-determinánsai ellen
1 HU 202 927 B 2 Az I. példában részletesen leírt folyamatot alkalmazva a monoklonális antitestek in vivo aktivitásának becslésére a következő eredményeket nyertük (6. táblázat), amelyek világosan demonstrálták, hogy a 13C1 és 6G2 antitestek védelmet nyújtanak a homológ törzs halálos adagja ellen. 6. táblázat In vivo védelemre vonatkozó tanulmányok 13C1 élők száma/teljes szám 3 nappal a beadás után 13 Cl (Anti-Fisher-féle 5. immun-típus) CSB7 (Anti-Fisher-féle 1. 10/10 immun-típus) 0/10 További változás 3 nap után nem történt Fertőzési adag: 5 LD50 élő Fisher-féle 5. immun-típusú baktérium 5G2 élők száma/teljes szám 3 nappal a beadás után 5G2 (Anti-Fisher-féle 6. immun-típus) 10/10 C5B7 (Anti-Fisher-féle 1. immun-típus) 0/10 További változás 3 nap után nem történt Kihívási adag: 5 LD5 élő Fisher-féle 6. immun-típusú baktérium V. példa Az V. példa módszert mutat be Fisher-féle 7. immun-típusú P. aeruginosa elleni humán monoklonális antitest előállítására, továbbá bemutatja az említett antitest védő aktivitását in vivo a homológ törzs halálos kimenetelj fertőzése ellen. Egy epehólyag-fibrózisos betegtől, akiről ismert volt, hogy krónikus P. aeruginosa fertőzésben szenved, perifériás vérmintát vettünk. Egymagvú sejteket különítettünk el a vérből olyan módon, ahogyan ezt az I. példában leírtuk. Az érzékeny B sejtek sejttel hajtott transzformálását a II. példában leírtak szerint hajtottuk végre azzal a kivétellel, hogy nyolc lemezet oltottunk be 8000 E’PBL plusz 60 000 1A2 sejt/üreg-gel kerekfenek J, 96 üreges lemezeken. A tenyészet felülúszóinak átvizsgálását fajlagos antitestekre a IV. példában leírtak szerint hajtottuk végre. Az üregek egyikének, a 8E7 jelűnek felülúszója pozitív eredményt adott, de csak a Fisher-féle 4-7. immuntípusú lemezeken, ezt később Fisher-féle 7. típusra fajlagosnak határoztuk meg, amikor az egyedi immun-típusú antigén-lemezeken határoztuk meg. Az izotípus meghatározás, amelyet a IV. példában leírtak szerint végeztünk, megmutatta, hogy ez IgM izotípusú, a Fisher-féle 7. immun-típusra fajlagos antitest. A 8E7 üreg fajlagos antitest-termelő sejtjeinek klónozását a IV. példában leírt folyamatot követve hajtottuk végre. Az így létrejött klónozott sejtvonalat, amely anti-Fisher-féle 7. immun- típusú humán monoklonális antitestet termelt, 8E7-nek jelöljük. Az ez által a vonal által termelt monoklonális antitest ugyanezt a jelzést viseli. A jelen szabadalmi bejelentés benyújtása előtt az itt leírt 8E7 sejtvonalat elhelyeztük az Amerikai Fajta- tenyészet Gyűjteményben (ATCC) ahol ez a CRL 8795 jelzést kapta. AIV. példában leírt módon végrehajtott immun-folt elemzés a hét Fisher-féle immun-típus mindegyikéből nyert külső membrán- készítményeken (OMP) 8E7 monoklonális antitesttel csak a Fisher- féle 7. immuntípusú baktériumból nyert OMP-n mutatott pozitív reakciót. A reakció szabályos térközű csíkok létra-szerű profilját eredményezte, ami arra vall, hogy az LPS a felismert molekuláris cél. Az immun-folt profil-változatlan maradt, amikor a Fisher- féle 7. immun-típusú OMP-t melegítettük és K-proteinázzal kezeltük (lásd IV. példa) az elektroforézis előtt, tovább erősítve azt a feltevést, hogy az LPS a cél-antigén. Az I. példában részletezett folyamatot alkalmazva a 8E7 monoklonális antitest in vivo aktivitásának becslésére következő eredményeket nyertük (7. táblázat), amelyek világosan demonstrálták, hogy a 8E7 antitest védelmet nyújt a Fisher-féle 7. immum-típusú baktériumok halálos kihívást jelentő adagja ellen. 7. táblázat In vivo védelemre vonatkozó tanulmányok 8E7 élők száma/teljes szám 3 nappal a beadás után 8E7 (Anti-Fisher-féle 7. immun-típus) CSB7 (Anti-Fisher-féle 10/10 1. immun-típus 1/10 További változás 3 nap után nem történt Fertőzési adag: 5 LDjo élő Fisher-féle 7. Immun-típusú baktérium VI. példa A VI. példa módszereket mutat be a P. aeruginosától különböző Pseudomonas-fajok LPS molekuláin levő szerotípusos determinánsok elleni humán monoklonális antitestek előállításához. A példa továbbá módszereket mutat be az így termelt humán monoklonális antitestekből olyanok kiválasztására, amelyek védő hatást mutatnak emlősökben homológ baktériumok halálos adagja ellen. Az I-IV. példákban leírt eljárásokat lehet ismételni, kiindulási anyagként olyan limfocitákat alkalmazva, amelyeket más Pseudomonas-fajoknak (pl. P. mailei, P. Pseudomallei, P. fluorescens, P. putida, P. cepacia, P. stutzeri és P. maltophilia) kitett humán donorokból nyertünk ki. A lehetséges donorokat úgy lehet átvizsgálni, ahogyan ezt a IV. példában bemutattuk, hogy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 13
