202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 Rezisztencia átadó gén Az organizmus, amely a gént tartalmazza A plazmid, amely a gént tartalmazza A deponálás letéti száma Utalás arra a közleményre, amely leírja a rezisztencia átadó gént eritromicin: ermD, egy rRNS metiltranszferáz Bacillus licheniformis pBD90 Nincs deponálva Gryczan és munkatársai: Mol. Gen. Genet. 194, 349 (1984) eritromicin: ermC, egy rRNS metiltranszferáz Staphylococcus aureus pEI94 Nincs deponálva Shivakumar és Dubnau: Nucl. Acids. Res. 9, (11), 2549 (1981) Bár a fenti módszer elsősorban antibiotikum rezisztencia átadó gének klónozásához hatásos út, a módszer adaptálható antibiotikum bioszintetizáló gének klónozására is a klónozott szekvenciákat elég nagynak tartva, úgy, hogy az antibiotikum rezisztencia átadó géneket szegélyező gének is klónozódjanak azonos DNS szegmensen, mint az antibiotikum rezisztencia átadó gén. Ezért a jelen módszer magában foglalja egy organizmus egy antibiotikum rezisztencia átadó génjének izolálását is abból a célból, hogy az antibiotikum rezisztencia átadó génhez kötött vagy azzal szomszédos antibiotikum bioszintetizáló géneket nyerjük. Amikor egy rezisztencia átadó gént alkalmazunk, pl. az első táblázatban felsorolt gének valamelyikét, a jelen módszerben, kívánatos csak a gén fehérje-kódoló szekvenciáját, vagy annak bizonyos szubfragmensét jelezni, egy antibiotikum bioszintetizáló gént tartalmazó DNS szegmens azonosításához való felhasználáshoz. Természetesen az előző táblázatban található antibiotikum resziztencia átadó gének nem mindegyikének van meg a szekvenciája, így ezeknek a géneknek a fehérje-kódoló szekvenciáinál a pontos határok ismeretlenek. Lehetséges azonban eltüntetni bármilyen extra DNS-t, amely nem szükséges a rezisztencia átadásához, mielőtt felhasználnánk az antibiotikum rezisztencia átadó gént a jelen módszerben. Annak célja, hogy a jelen módszerben az antibiotikum rezisztencia átadó génnek csak a fehéije-kódoló szekvenciáját alkalmazzuk, az, hogy elejét vegyük az antibiotikum rezisztencia átadó génnel szomszédos DNS szekvenciák hibridizálásának azokban a kromoszomális vagy plazmid DNS-ekben jelen levő homológ szekvenciákkal, amelyekből az antibiotikum bioszintetizáló géneket izolálni kívánjuk. Mivel ezek a szegélyező szekvenciák lehet, hogy nem fajlagosak az antibiotikum rezisztencia átadó génekre vagy antibiotikum bioszintetizáló génekre, ezeknek a szekvenciáknak a jelenléte téves pozitív eredményekhez vezethet, ha a szekvenciák jelen vannak a jelen módszer szerinti hibridizálási lépés során. Ha a vektor azonban, amelyen az antibiotikum rezisztencia átadó gén jelen van, nem homológ a kromoszomális vagy plazmid DNS- sel, amelyekből az antibiotikum bioszintetizáló géneket izolálni kívánjuk, azoknak a vektor- szekvenciáknak a jelenléte nem károsítja a jelen módszer sikeres működését. Abból a célból, hogy azonosítsunk bármilyen antibiotikum rezisztencia átadó DNS-t, amely hibridizál egy antibiotikum- termelő organizmus kromoszomális vagy plazmid DNS-ével, az antibiotikum rezisztencia átadó DNS-t jelezni kell. Általában a DNS-nek ezt a jelzését olyan technikákkal végezzük, amelyek radioaktív molekulákat hoznak létre, mint pl. radioaktív foszfor ( P) vagy radioaktív foszfort tartalmazó P dezoxiribonukleotidok beépítése a DNS-be. A DNS jelzésének egyik ilyen módszerét a radioaktív dezoxiribonukleiotidok alkalmazása révén a 3. példában mutatjuk be. A DNS jelzésének egyik ilyen a radioaktiv dezoxiribonukleotidok alkalmazása révén a 3. példában mutatjuk be. A DNS jelzésének egy másik módszere magában foglalja a DNS biotinilezését; ezt a módszert a Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, Maryland, 20877) írja le és hozza kereskedelmi forgalomba; ez a módszer jól működik a jelen találmány szerinti módszerben. Ä jelen találmány nem korlátozódik az antibiotikum rezisztencia átadó gén jelzésének egy adott módszerére. Miután az antibiotikum rezisztencia átadó gént jelzéssel láttuk el, a rezisztencia átadó gént érintkezésbe hozzuk az antibiotikum-termelő organizmusokból származó kromoszomális vagy plazmid DNS-sel olyan körülmények között, amely lehetővé teszi, hogy az antibiotikum rezisztencia gén DNS-ének egyedi szálai összeforrjanak az antibiotikum termelő organizmus egyszálú kromoszomális vagy plazmid DNS-nek homológ területeivel. Ezt az összeforrasztási műveletet hibridizálásnak hívják; a folyamatot részletesebben a 4. példa írja le. A hibridizálási reakció után az össze nem forrasztott, jelzett DNS-t kimossuk a rendszerből. A mosás különböző paramétereit, amelyek szintén a 4. példában vannak leírva, lehet beállítani ahhoz, hogy a homológia olyan mértékét hozzuk létre, hogy egy jelzett DNS összeforrott maradjon. A jelen találmány szerinti módszerben a mosásokat úgy szabályozzuk, hogy a jelzett DNS legalább 50%-ban homológ legyen az antibioti-20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
