202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 kum-termelő organizmus kromoszomális vagy plazmid DNS-éhez a rendszerből való kimosás előtti állapothoz viszonyítva. A jelzett DNS-t, amely a rendszerben marad, az antibiotikum termelő organizmus kromoszomális és plazmid DNS-éhez kötjük, amely pedig egy szubsztrátumhoz, általában nitrocellulózhoz, van kötve. Ezt a szubsztrátumhoz kötött DNS-t úgy állítjuk elő, hogy a fent említett genetikai könyvtárat tartalmazó organizmust egy bizonyos anyagon, pl. nitrocellulózon tenyésztjük; az organizmust egy bizonyos anyagon, pl. nitrocellulózon tenyésztjük; az organizmust lizáljuk olyan körülmények között, amely az organizmus DNS- ét olyan mértékben denaturálja, hogy a nitrocellulózhoz egy szálú formában válik kötötté; és végül a nitrocellulózhoz kötött DNS-t olyan körülmények között kezeljük, pl. megnyújtott hőkezeléssel, amely előidézi, hogy a DNS kovalensen kötötté váljék a nitrocellulózhoz. Ezen a módon az antibiotikum-termelő organizmus DNS-e egy szubsztrátumhoz kötötté válik egyszálú formában, úgy, hogy a hibridizálás az antibiotikum rezisztencia átadó DNS-sel könnyen végbemehet. Egy másik rendszer az antibiotikum-termelő organizmusok DNS-ének elkészítéséhez a hibridizálás céljaira magában foglal egy anyagot, pl. egy nylon-alapú membránt vagy Whatman kromatográfiás papírt, amelyhez a DNS kötődik olyan módon, hogy összefonódottá válik azokkal a rostokkal, amelyből a nevezett anyagot készítették. A hibridizálás előtt vagy annak során azonban a DNS- t egyszálúvá kell denaturálni úgy, hogy az antibiotikum rezisztencia átadó DNS hibridizálódni tudjon vele. Az antibiotikum termelő organizmus DNS-ének immobilizálására és denaturálására alkalmazott aktuális módszer semmiképpen sem korlátozza a jelen találmány szerinti módszert. A technikák széles választéka létezik, vagy lehetséges egy genetikai könyvtár DNS- ének kötésére egy szubsztrátumhoz olyan módon, hogy a hibridizálás egy jelzett antibiotikum átadó DNS fragmenssel végbemehessen úgy, hogy a genetikai könyvtárnak azok a fajlagos vektorai, amelyek hibridizálnak, azonosíthatók legyenek. A jelen találmány szerinti módszer nem korlátozódik bármilyen adott módszerre vagy módszerek sorozatára, amelyek a hibridizálási lépés kivitelezésére szolgálnak. Az antibiotikum-termelő organizmusok immobilizálásához és denaturálásához alkalmazott módszer lehetővé kell, hogy tegye azoknak a rekombináns vektoroknak az ezt követő azonosítását a genetikai könyvtárban, amelyek olyan szekvenciákat tartalmaznak, amelyekhez az antibiotikum rezisztencia átadó gén hibridizálódik. Általában ez a cél úgy teljesül, hogy a genetikai könyvtár rekombináns vektorait tartalmazó gazdaszervezetet egy minta-lemezen tenyésztjük, tenyésztjük, amely speciálisan van jelezve vagy kiképezve. Ennek a mintalemeznek a replikáival tenyészetek sorozatát készítjük el, előnyösen olyan anyagon, amelyet a genetikai könyvtárban levő DNS kötéséhez alkalmazunk. A replikákat úgy jelöljük meg, hogy a replika-lemezen levő telepeket azonosítani lehessen annak a mintalemeznek a telepeivel, amelyből ezek eredtek; a mintalemez jelölései vagy kiképzése segít ebben a célban. A replika- lemezeket ezután alkalmazzuk a jelen találmány céljaira. A minta-lemezt megőrizzük, hogy tenyészetei épek és élők maradjanak, úgy, hogy miután a genetikai könyvtárnak azokat a rekombináns vektorait, amelyek az antibiotikum bioszintetizáló géneket tartalmazzák, azonosítjuk, az ezeket a rekombináns vektorokat tartalmazó organizmusokat izolálni és tenyészteni lehessen. Az antibiotikum bioszintetizáló géneket tartalmazó rekombináns vektorokat azzal a módszerrel összhangban azonosítjuk, amelyet az antibiotikum rezisztencia átadó DNS jelzésénél alkalmaztunk. Ha olyan módszert alkalmazunk, amely a DNS radioaktiv jelzését hasznosítja, az azonosítást a radioaktivitás mérése követi, amely megőrződött azon az anyagon, amely a genetikai könyvtár DNS-t megköti, a hibridizálási és mosási lépés után. A radioaktivitás kényelmesen mérhető a genetikai könyvtár DNS-hez kötött anyag (a „szűrők”) ráhelyezésével röntgen-filmre a hibridizálási és mosási lépések után. Más módszereket, mint pl. azokat, amelyek a szcintillációs vagy Geiger számlálókat alkalmazzák, szintén lehet alkalmazni a jelen módszerben. Amikor a biotinilező módszert alkalmazzuk, a szűrőket olyan festék hatásának tesszük ki, amely lehetővé teszi, hogy azokat a vektorokat, amelyek az antibiotikum rezisztencia átadó génekhez hibridizálódtak, azonosíthassuk kolorimetriás eszközökkel. Amikor egy antibiotikum termelő organizmusból származó genetikai könyvtár egy rekombináns vektoráról kimutatjuk, hogy olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek homológok egy antibiotikum rezisztencia átadó gén DNS szekvenciáihoz és hibridizálódnak ezekhez, szükségessé válik azonosítani azokat az antibiotikum bioszintetizáló géneket, amelyek az antibiotikum rezisztencia átadó homológ szekvenciákhoz kötődnek, és amelyek jelen is vannak a plazmidban. Számos módszer létezik antibiotikum bioszintetizáló gének jelenlétének és típusának azonosítására egy vektoron; a módszereket az alábbiakban röviden összefoglaljuk. Egy antibiotikum bioszintetizáló út jelenlétét egy rekombináns DNS klónozó vektoron úgy lehet meghatározni, hogy a rekombináns vektort egy olyan gazdaszervezetbe vezetjük be, amely természetes módon nem termel antibiotikumot, de amely felismeri a bioszintetikus út génjeinek szabályozó szignáljait és a rekombináns vektor replikációs funkcióit. Egy antibiotikum bioszintetizáló út jelenlétét, vagy legalább egy rejtett bioszintetizáló útnak egy szabályozóját jelzi egy antibotikum termelése a transzformált organizmus által, mivel a nem transzformált organizmus nem termel antibiotikumot. Egy más módszer szerint a bioszintetizáló utat tartalmazó rekombináns vektort be lehet vezetni egy olyan organizmusba, amely termel antibiotikumot, és egy új antibiotikum bioszintetizáló út, vagy legalábbis antibiotikum bioszintetizáló gének jelenlétét egy olyan antibiotikum termelése jelezheti, amelyet a nem transzformált organizmus nem termel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 11
