202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 ring Co., Inc., New York, New York 10028) 7-10 Klett egységet (optikai sűrűség: 1 OD600-270 Klett egység-10'telepképző egység/ml) mutat. A tenyészet egy részletét azután módosított R2-agar lemezekre helyezzük [Baltz és Matsushima: J. Gen. Microbiol. 127, 137 (1981)] és 30 °C hómérsékleten inkubáljuk, amíg a spóraképzés megtörténik, általában mintegy 3 napos inkubálás után. A spórákat összegyűjtjük és vízben szuszpendáljuk 108-109 spóra/ml koncentrációban. Ebből a spóraszuszpenzióból mintegy 0,1 ml-t inokulálunk 10 ml TSB-ben, amely 10,3% szacharózzal és 0,5% glicinnel van kiegészítve. A tenyészetet ezután ultrahanggal kezeljük. Branson ultrahangos vízfürdőben (Branson Cleaning Equipments Co., Shelton, Connecticut) egy percig, hogy diszpeigáljuk a spórákat. A tenyészetet azután forgó vízfürdőben inkubáljuk 240-260 fordulat/percnél 29 °C hőmérsékleten 60-65 órán át. A tenyészetet teflon mozsár szövetőrlővel homogenizáljuk, majd 1 másodpercig ultrahanggal kezeljük 76 wattnál, Branson W185 modell ultrahangos készüléket alkalmazva. Az ultrahanggal kezelt sejteket centrifugálással (-2400 fordulat/perc) összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 10 ml P tápközegben [Baltz: J. Gen. Microbiol. 107, 93 (1978)]. Ezt a folymatot kétszer megismételjük, de az utolsó újra szuszpendálást olyan P tápközeggel végezzük, amely 1 mg/ml háromszor kristályosított tojásfehérje-lizozimot (Calbiochem, LaJolla, California 92037) is tartalmaz. Az így létrejött protoplasztokat összegyűjtjük és kétszer 10 ml P tápközeggel mossuk. A protoplasztokat végül 10 ml P tápközegben újra szuszpendáljuk. Egy külön csőben 0,8 pg borjú timusz DNS-t (átlagos méret mintegy 5 kb) 4 pl térfogatban, összekeverünk 1,5 pg protamin szulfáttal (Calbiochem) 1,5 pl térfogatban. 1 pg pKC488-at, amelyet 10 pl-re egészítettünk ki P tápközeget alkalmazva, adunk a borjú timusz DNS-protamin szulfát keverékhez. 200 pl protoplasztot és 500 pl szűréssel sterilezett 55%-os PEG 1000 (Sigma) oldatot (P tápközegben) adunk ezután a borjú timusz DNS-protamin szulfát oldathoz. Keverés után a cső tartalmát szobahőmérsékleten inkubáljuk egy percig. Az így létrejött transzformált protoplasztokat azután 1:10; 1:100; és 1:1000 arányban hígítjuk P tápközeggel, és minden hígításból 100 1-es részleteket egyenként szélesztünk lágy agar fedőrétegre módosított R2-agar lemezeken, lényegében Baltz és Matsushima eljárásával összhangban [J. Gen. Microbiology, 127, 137 (1981)]. A lemezeket 29 °C hőmérsékleten inkubáljuk 16-24 órán át. Ezután egy második lágy' agar fedőréteget helyezünk a lemezekre, amely réteg annyi agramicint vagy eritromicint tartalmaz, hogy a végső koncentráció diffúzió után 25 pg/ml apramicin vagy 200 pg/ml eritromicin legyen. A lemezeket azután 29 °C hőmérsékletre helyezzük és inkubáljuk, amíg a telepek láthatóvá válnak. A pKC488 rekombináns vektor a Streptomyces lividans TK23-at transzformálja apramicin és eritromicin rezisztenciára. B. Streptomyces lividans TK23lpKC488 transzformánsok elemzése antibiotikum aktivitás kifejeződésére 1. Lemez tampon mérés Streptomyces lividans TK23/pKC488 transzformánsokat tenyésztünk R2 agar lemezeken, amelyek 25 pg/ml apramicint is tartalmaznak, amíg a telepek 5-10 mm átmérőt el nem érnek. A telepeket azután tamponnal felszedjük, és a tamponokat átvisszük, steril átvivő csövet alkalmazva (Spectrum Medical Industrial, Inc., Los Angeles, California 90054) triptikáz szója agar (TSA) lemezekre, amelyeket előzőleg felülrétegeztünk lágy agar tápközeggel (Difco Laboratories, Detroit, Michigan 48232), amely Micrococcus luteus X160-at (ATTC 9341) is tartalmaz. A lemezeket 34 'C hőmérsékleten inkubáljuk 16-24 órán át. A Micrococcus luteus érzékeny eritromicin A, B, C, D és E-re, és rezisztens apramicinre. Következésképpen ez a M.luteus törzs nem tud nőni egy tampon körül, amely olyan Streptomycest tartalmaz, amely eritromicint választ ki. A lemeztampon mérésben, amelyet S. lividans TK23/pKC488-cal végzünk, a M.luteus növekedés gátlásának világos zónái vannak a S. lividans TK23/pKC488 tamponjai körül. Ezek a gátlási zónák jelzik, hogy a transzformánsok eritromicint termelnek. 2. Extraktumok készítése kromatográfiához és bioautográfiához A 7. példa (B) (1) részében elkészített tamponokat pasztává őröljük teflon mozsár szövetőrlőben, amelyben 1 ml TSB van; a TSB pH-ját előzőleg 8,0-ra állítjuk be 100 pl 1 n NaOH hozzáadásával. Azonos térfogatú metanolt adunk a pasztához és összekeverjük vele, és az így létrejött keveréket szobahőmérsékleten 15-30 percig inkubáljuk. A keveréket ezután röviden centrifugáljuk, hogy üledékbe vigyük az agar törmeléket, és a felülúszót ötödrészére koncentráljuk szobahőmérsékleten végzett bepárlással. 3. Kromatográfia Olyan papírkromatográfiás rendszer az előnyös, amely jól elválasztja egymástól az eritromicin faktorokat. A papírkromatográfíát a 7. példa (B) (2) részében előállított koncentrált extraktumokkal végezzük Whatman N51 papíron, vagy alumíniumra helyezett cellulóz lemezeken (EM Reagents, DC- Alufolien Cellulose Art. 552). A kifejlesztett kromatogramok bioautográfiája alapján nyert bioaktivitás együtt vándorol az eritromicin A standarddal (az eritromicin D együtt vándorol az eritromicin A-val) az összes vizsgált oldószer-rendszerben, amelyek a következők: (a) 1% (térfVtérf.) metil-izobutilketon és 0,5% NH4OH desztillált vízben; (b) 17,4 g K2HPO4 és 30 ml etanol 1 liter desztillált vízben; és (c) 7% (súly/térf.) NaCl és 2,5% (térfAérf.) metil-etil-keton desztillált vízben. Néhány transzformáns termel olyan faktorokat is, amelyek együtt vándorolnak az eritromicin B és C prekurzorokkal. 4. Bioautográfia A kifejlesztett kromatogramokat alaposan kiszárítjuk elszívó fülkében legalább két órán át. A kroma-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 17
