202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására

1

HU 202 924 B

2

togramokat azután felülettel lefelé Micrococcus luteus XI 60-nal beoltott TSA lemezekre helyezzük 30 percre. A kromatogamokat lehámozzuk a lemezekről és a lemezeket 34 °C hőmérsékleten inkubáljuk 16-24 órán

át.

A Streptomyces lividans TK23/pKC488-ból nyert extraktumokhoz tartozó kromatogaramok a kromatogramon levő anyagokból eredő gátlási zónákat mutatnak, amelyek együtt vándorolnak az eritromicin A-val vagy prekurzoraival, pl. eritromicin B-vel, C- vei vagy D-vel, mint standardokkal.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás antibiotikum átadó génhez kötött antibiotikum bioszintetizáló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására és azonosítására, azzal jellemezeve, hogy

1) kromoszomális- és plazmid-DNS-t izolálunk egy antibiotikumot termelő organizmusból;

2) az izolált kromoszomális és plazmid-DNS genetikai könyvtárát elkészítjük olyan módon, hogy a könyvtár rekombinánsai tartalmazzák az izolált DNS~1- 45 kb méretű fragmenseit;

3) egy jelzett antibiotikum-rezisztenciát átadó gént hibridizálunk a könyvtárhoz;

4) megvizsgáljuk, hogy a könyvtár mely rekombináns vektorai hibridizálódnak az antibiotikum rezisztenciát átadó génhez; és

5) izoláljuk a hibridizált vektorokat a fenti könyvtárból.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-t izolálunk, mely tartalmaz egy antibiotikum-bioszintetizáló szakaszt.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t Actinomadura, Actinoplanes, Bacillus, Cephalosporium, Corynebacterium, Dactylosporangium, Micromonospora, Nocardia, Penicillium, Saccharopolyspora, Streptomyces vagy Streptoverticillium nemzetségek valamely fajából izoláljuk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-1 a Streptomyces nemzetség albireticuli, ambofaciens, antibioticus, aureofaciens, cattleya,

chartreusis, cinnamonensis, clavuligerus, erythreus, fradiae, hygroscopicus, kanamyceticus, lavendulae, macrosporeus, narbonensis, olivaceus, rimosus, tenebrarius, thermotolerans, toyocoensis vagy Virginiáé fajából izoláljuk.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-t az erythreus vagy fradiae fajból izoláljuk.

6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy apramicin, valamely p-laktám, eritromicin, higromicin, kanamicin, metalonomicin, neomicin, spiramicin, tobramicin, tiostrepton, tilozin vagy viomicin rezisztenciát átadó gént alkalmazunk.

7. A 3. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy acetil-transzferáz, béta-laktamáz, foszfotranszferáz vagy rRNS metiltranszferáz rezisztenciát átadó gént alkalmazunk.

8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy eritromicin vagy tilozin rezisztenciát átadó gént alkalmazunk.

9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rRNS metiltranszferáz aktivitást kódoló gént alkalmazunk.

10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pKC488 kozmidot izoláljuk.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pKC488 kozmidban található eritromicin bioszintézisben aktív enzimet kódoló gént alkalmazunk.

12. Eljárás Streptomyces transzformált gazdasejt elő állítására, azzal jellemezve, hogy valamely Streptomyces sejtet pKC488 kozmiddal transzformálunk.

13. Eljárás pKC488 kozmid replikálására, azzal jellemezve, hogy pKC488 kozmiddal transzformált Escherichia vagy Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmusokat tenyésztünk.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás pKC488 kozmid replikálására, azzal jellemezve, hogy pKC488 kozmiddal transzformált E. coli K 12 SF8 törzset tenyésztünk.

15. A 13. igénypont szerinti eljárás pKC488 kozmid replikálására, azzal jellemezve, hogy pKC488 kozmiddal transzformált Streptomyces lividans TK23 törzset tenyésztünk.

5

10

15

20

25

30

35

40

18