202924. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikumok bioszintézisét kódoló gének és az azt tartalmazó vektorok izolálására
1 HU 202 924 B 2 6. példa A radioaktívon jelzett eritromicin rezisztencia átadó gén hibridizálása egy Streptomyces erytrhreus genetikai könyvtárat tartalmazó szűrőhöz, és a hibridizált vektorok azonosítása A. Eló'-hibridizálás és hibridizálás A 3. példában készített 52 szűrőt bemerítjük 10 ml elő- hibridizáló keverékbe, amely következő összeállítású oldat: 50% ionmentesített formamid; 0,1% SDS; 10 mmól/1 HEPES, pH-6,9; 1,0 mmól/1 EDTA; 0,75 mól/1 Na-citrát; 0,75 mól/1 NaCl; 0,02% Ficoll (400 000 molekulasúlyú); 0,02% polivinilpirrolidon; és 0,02% BSA. A szűrőket 4 órán át merítjük be elő-hibridizáló keverékbe 37 °C hőmérsékleten. Az előhibridizálás után az 5. példában előállított pKC407 plazmid DNS-t 100 °C hőmérsékleten inkubáljuk 5 percig, majd azonnal hozzáadjuk 27 ml előhibridizáló keverékhez a hibridizáló keverék kialakításához. A szűrőket azután eltávolítjuk az előhibridizáló keverékből és hat vagy kevesebb csoportban bemerítjük a hibridizáló keverék 3 ml-es alikvotjaiba és 42 “C hőmérsékleten inkubáljuk egy éjszakán át. Ennek az inkubálásnak a folyamán a jelzett DNS a szűrőkön elhelyezett genetikai könyvtárhoz hibridizálódik. A formamid százalékát növelve a hibridizáló keverékben, vagy az inkubálás hőmérsékletét növelve növekszik a homológja, amely ahhoz szükséges, hogy a jelzett DNS kötődjék a szűrőn levő genetikai könyvtár rekombináns vektoraihoz. Ez a két változó, a formamid százaléka és a hibridizálás hőmérséklete, szolgál kontrollként a jelen találmány szerinti módszerben, és lehetővé teszi a homológia kiválasztását az antibiotikum rezisztencia átadó gén és a genetikai könyvtár DNS között a kívánt 50-100% homológia tartományban. Az egy éjszakán át végzett inkubálás után a szűrőket finoman mossuk 300 ml, 0,75 mól/1 Na-citrátból, 0,75 mól/1 NaCl-ből és 0,2% SDS-ből összeállított oldatban. A mosóoldatot mintegy 65 °C hőmérsékleten tartjuk. A mosást még kétszer megismételjük, majd a szűrőket két órára, szobahőmérsékleten 300 ml, 0,3 mól/1 Na- citrátból és 0,3 mól/1 NaCl-ből összeállított oldatba helyezzük. A szűrőket levegőn szárítjuk szobahőmérsékleten. A mosási lépés további kontrollt szolgáltat a homológia kiválasztására az antibiotikum rezisztencia átadó gén és a genetikai könyvtár vektorai között. A megnövelt mosási hőmérsékletek vagy csökkentett sókoncentráció növeli a homológia mennyiségét, amely szükséges, hogy a jelzett DNS hozzáforrjon a genetikai könyvtár vektoraihoz. így változtatva a sókoncentrációt vagy a mosóoldat hőmérsékletét, lehetővé válik a homológia olyan változtatása, hogy a jelen találmány szerinti módszer által igényelt 50-100%-os értéktartományba essék. B. Azonosítás A levegőn szárított szűrőket átlátszó műanyagba csomagoljuk és kartonlemezre helyezzük, majd Kodak (Rochester, New York 14650) XAR-5 filmet helyezünk a szűrők tetejére. A műveleteket sötétszobában hajtjuk végre. Egy Lightning Plus R erősítő ernyőt (Dupont DeNemours et Co., Inc., Photoproducts Department, Wilmington, Delaware 19898) helyezünk megfelelő orientációban a film tetejére. A filmet megjelöljük úgy, hogy ezt később be lehessen tájolni azokhoz a szűrőkhöz viszonyítva, amelyekre ezt helyezzük. A filmet, a szűrőket és az erősítő ernyőt azután egy fénytől elzárt dobozba helyezzük és -70 °C hőmérsékleten 2 órán át inkubáljuk. Az inkubálási (vagy exponálási) időt lehet változtatni, hogy az exponálás megfelelő mennyiségét adja bármilyen adott kísérlethez. Miután a filmet előhívtuk, sötét foltok tűnnek fel mindenütt, ahol jelzett pKC407 DNS kötődik a genetikai könyvtár egy rekombináns vektorával, amely viszont a szűrőkhöz kötődik. Ezeket a foltokat lehet azonosítani a mintalemez egy adott üregéhez, mivel különös gondot fordítunk arra, hogy minden mintalemezt, a megfelelő szűrőket, és a röntgen-filmeket megfelelően jelöljük be. A párhuzamos szűrők alkalmazása segít a téves pozitív eredmények kiküszöbölésében. Az összesen 2500 klónból 3 ad pozitív eredményt. Azokat a rekombináns kiónokat, amelyekről a szűrőkön kimutatjuk, hogy olyan DNS-t tartalmaznak, amelyek antibiotikum rezisztencia átadó génhez hibridizálódnak, a mintalemezről felszúrjuk, tenyésztjük, és a 4 A. példa szerinti eljárásnak vetjük alá abból a célból, hogy izoláljuk kozmid DNS-üket. Ezt a kozmid DNS-t azután megvizsgáljuk antibiotikum bioszintetizáló gének jelenlétére. A három kozmid egyikét, amelyet pKC488-nak nevezünk, kiterjedten elemezzük. 7. példa A pKC488 kozmid elemzése antibiotikum bioszintetizáló gének jelenlétére A. Streptomyces lividans TK23 transzformálása és az antibiotikum aktivitás kifejeződése A Streptomyces lividans TK23 nem termel egyetlen klinikailag jelentős antibiotikumot sem; bár termel egy pigmentet, az actinorodint, gyenge antibiotikum aktivitással. Ezenkívül a S. lividans TK23 érzékeny eritromicinre. Következésképpen a S. lividans TK23-at, mint jó gazdaszervezetet választjuk ki a 6. példában azonosított kozmidok vizsgálatára mind egy eritromocin rezisztencia átadó gén jelenlétére, mind az antibiotikum bioszintetizáló gén jelenlétére. Mivel a klónozott DNS eredete a pKC488 kozmidban S. erythreus, bármilyen antibiotikum bioszintetizáló génről, amely a plazmidokon jelen van, elvárható, hogy eritromicin bioszintetizáló gén legyen. A Streptomyces lividans TK23-at liofilezett formában kapjuk az NRRL-től, ahol az az NRRL 15826 letéti számon található. A liofilezett sejteket 10 ml triptikáz szója tápközegbe visszük (TSB) (BBL, Cockeysville, Maryland, 21030) és inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten forgó vízfürdőben (New Brunswick, Edison, New Jersey 08817) 240-260 fordulat/percnél 1-3 napon át. Az inkubálási időszak akkor érjen véget, amikor a tenyészet Klett leolvasása (Klett Manufactu-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
