202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 sejtvonal humán lizozimet termel [P. Ralph, M.A.S. Moore és K. Nillson, J. Exp. Med., 143, 1528-1533 (1976)]. Hogy az U-937 sejtvonalat a poliA+RNS kiindulási anyagaként használhassuk a HLZ-cDNS szintetizálásához, meghatározzuk az U-937 sejtek által a tápoldatba kiválasztott HLZ aktivitását. RPMI tápoldatba (10% fetális borjúszérum, 100 egység/ml penicillin, 50 egység/ml sztreptomicin) frissen beoltott U-937 sejtek tenyészetét 3.102 * * 5 sejt/ml sűrűségig tenyésztjük 37 °C- on 3 napon át. A sejteket centrifugálással távolítjuk el és a tápoldatba kiválasztott HLZ aktivitását Gold és Schweiger módszerével határozzuk meg [L.M. Gold és M. Schweiger, Methods in Enzymology, XX. kötet, C. fejezet, 537-542 oldal; szekesztők: K. Moldave és L. Grossman, kiadó: Academic Press, New York és London (1971)]. A radioaktív szubsztrátummal való két órás inkubálás után felszabadult radioaktivitást a 2 ml- 5 es inkubációs keverékekből kivett 100 pl-nyi alikvot mennyiségekben megmérjük. Negatív kontroll gyanánt az RPMI tápoldat szolgál. Az U-937 sejtek által termelt HLZ mennyiségi meghatározása standard görbe segítségével történt [humán lizozim emberi tejből (Sigma); aktivitásának meghatározása RPMI tápoldatban történik]. Az eredményeket az 1. táblázat foglalja össze. 10 1. táblázat Tápoldat hígítása Beütések száma 100 pl inkubációs keverékben Beütések száma 100 pl tápoldatban A kiválasztott HLZ mennyisége (pg/ml) 2* 10 457 20 914 2,09 4* 3 963 15 852 1,59 10* 1 485 14 850 1,49 20* 794 15 880 1,59 Az 1. táblázat szerint az U-937 sejtek körülbelül 1,5 pg HLZ-t választanak ki az RPMI tápoldat 1 ml- 30 ébe. Ebből azt következtettük, hogy az U-937 sejtvonal használható forrása lesz a HLZ mRNS-nek. 2. példa Humán lizozim mRNS tartalmú RNS előállítása 35 a) Az össz-RNS izolálása Az emberi hisztiocitás lymphomából származó U- 937 sejtvonalat RPMI 1640 tápoldatban (10% fetális borjú szérum, 100 E/ml penicillin, 50 E/ml sztreptomicin) tenyésztjük 37 'C-on. A sejteket centrifugálás- 40 sál gyűjtjük össze 1,6 liter tenyészetből. A sejteket egyszer mossuk 50 ml jéghideg 10 mM trisz.HCl-t (pH=7,4), 140m M NaCl-t és 1,5 mM MgCl2-t tartalmazó oldattal, majd jéghideg 10 ml 10 mM trisz.HCl (pH-8,4), 140 mM NaCl és 1,5 mM MgCb tartalmú 45 oldatban reszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz Nonidet P40 nem ionos detergens [polietilénglikol- (4-izooktilfenil)-éter] adunk 0,5% végkoncentrációig. A szuszpenziót 5 percig jégben állni hagyjuk, majd 10 másodpercig erősen keverjük, hogy a sejtmembránok fel- 50 oldódjanak. A sejtmagokat ezután 4 °C-on való centrifugálással távolítjuk el. A felülúszó 10 ml-éhez 0,5 ml 20%-os SDS-t, 0,25 ml 2 mólos trisz.HCl-t (pH-9,0) és 0,1 ml 500 mmólos EDTA-t (pH-7,5) adunk. A mintához azonos mennyiségű frissen desz- 55 tillált és 10 mM trisz.HCl-el (pH-8) és 1 mM EDTA- val kiegyensúlyozott fenolt adunk és 10 percig erősen rázzuk. Ezután centrifugálással választjuk el a fázisokat. A vizes fázist kétszer extraháljuk úgy, ahogy fent leírtuk, végül azonos mennyiségű kloroformmal. Az 60 extraktumhoz 3 M kálium-acetátot (a vizes fázis térfogatának 1/10-e) és végül 2,5 térfogatrész etanolt adunk. Az oldatot -20 °C-on egy éjszakán át állni hagyjuk, a kicsapódott RNS-t centrifugálással összegyűjtjük, egyszer mossuk 3 ml 70%-os etanollal és vákuumban szárítjuk. Az RNS-t 3 ml vízben feloldjuk, kicsapjuk, összegyűjtjük, szárítjuk és mint fent, újra feloldjuk. A kitermelés mintegy 8 mg RNS. b) A poliA+RNS izolálása A poliA+RNS-t az össz-RNS-ből oligo(dT)-cellulóz (P-L Biochemicals Inc.) segítségével izoláljuk. Steril vízben 0,5 g oligo(dT)-cellulózt szuszpendálunk és 14°C-on egy éjszakán át állni hagyjuk. A következő nap egy DEP-pel kezelt, steril vízzel kimosott oszlopba (BioRad Plastic, 18 cm, 1,5 cm 0) töltjük a 0,5 g oligo(dT)-cellulózt, 3 ml proteináz-K (XI típusú proteáz, Sigma) oldattal mossuk és 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A proteináz-K-t 0,1* kiegyensúlyozó pufferben [1* kiegyensúlyozó puffer: 50 mM trisz.HCl (pH-7,4), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,2% SDS] oldjuk fel 1 mg/ml végkoncentrációig. Az oszlopot ekkor 5 ml steril 0,1 mólos NaOH-val mossuk, majd steril vízzel addig, amíg az eluátum el nem éri a pH-8 értéket, végül 1» kiegyensúlyozó oldattal. Az 500 pl vízben reszuszpendált össz-RNS-t 4,5 ml kiegyensúlyozó pufferrel hígítjuk, 5 percig 65 ‘C-on tartjuk (vízfürdőn), majd az előkészített oligo(dT)-cellulóz oszlopra visszük fel. Az eluátumot összegyűjtjük, még egyszer 5 percig tartjuk 65 'C-on és újra felvisszük az oszlopra. Az oszlopot 7 ml kiegyensúlyozó pufferrel mossuk, s ekkor a poliA'RNS eluálódik. 8
