202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 Frakciószedővel 1-1 ml-eket gyűjtünk és megmérjük minden frakció OÖ260 értékét. A poliA+RNS-t 5 ml steril vízzel eluáljuk. Mind a poliA"RNS-t, mind a poliA+RNS-t etanol jelenlétében egy éjszakán át -20 *C- on tartva, 0,3 ml NaOAC-tal csapjuk ki. 3. példa A HLZ-mRNS jelenlétének vizsgálata a) Kevert szekvenciájú oligonukleotidok szintetizálása Szilárd fázisú-foszfotriészter módszerrel [G. Alvaradó-Urbina, G.M. Sathe, W.C. Liv, M.F. Gillen, P. Duck, R. Bender és K.K. Ogilivie, Science, 214, 270- 274 (1981)] HLZ-vel homológ két pool kevert szekvenciájú oligonukleotidot szintetizálunk. Az EÍ-ON19 17mer oligonukleotid-minta keverék szerkesztésénél a humán lizozim protein [J. Jolles és P. Jolles, Helv. Chim. Acta, 54, 2668-2675 (1971)]; R.E. Canfield, S. Kammermann, J.H. Sobel és F.J. Morgan, Nature New Bioi., 232, 16-17 (1971); P. Jolles és J. Jolles, Molec. and Cellul. Biochem., 63, 165-189 (1984)] NH2-terminális végéről a 63-68. aminosav csoportból álló szekvenciát (l^r Trp Cys Asn Asp Gly) vettük alapul. Az EÍ-ON19 minta 16 oligonukleotid keverékéből áll, ezek szekvenciája a következő: 5’CCq TCqTIqCA CCa£ TA 3’ Az EÍ-ON20 17mer oligonukleotid-minta keverék szerkesztésénél a humán lizozim protein (lásd J. Jolles és munkatársai, R.E. Canfield és munkatársai, valamint P. Jolles és munkatársa fent idézett közleményét) NH2-terminális végéről a 26-31. aminosav csoportból álló szekvenciát (Ala Asn Trp Met Cys Leu) vettük alapul. Az EÍ-ON20 minta 32 oligonukleotid keverékéből áll, ezek szekvenciája a következő: A 5’ Aq qCA CAT CCA £ TT £ GC 3’ C b) Primer-extenziós analízis Az U-937 sejtvonalból izolált mRNS-t primer-extenziós módszerrel vizsgáljuk a HLZ-mRNS jelenlétére. Az EÍ-ON19 vagy EÍ-ON20 100 ng-ját 5’ végükön radioizotóppal jelezzük 60 perc alatt 37 *C-on, 20 pl reakcióelegyben. A reakcióelegy tartalma a következő: 70 mM trisz.HCl (pH-7,6), 1 mM MgCh, 30 pCi y-32P-ATP (5.000 Ci/mmól; Amersham PB .218), 100 pg/ml BSA, 10 mM DTT, 1 mM Spermidin [N(3-amino-propil)-l,4-butándiamin] és 2-4 egység polinukleotid kináz (New England Biolabs). A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 10 percig 70 °C-on hevítjük. A primer-extenziós reakciót 40 pl reakcióelegyben, 60 percen át 42 °C-on végezzük. A reakcióelegy a következőkből áll: 50 mM trisz.HCl (pH-8,3), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM nátrium-pirofoszfát, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dCTP, 1,25 mM dTTP, 150 ng U-937 sejtvonalból izolált mRNS, 40 ng jelzett EÍ-ON19 vagy EÍ-ON20 és 200 egység reverz transzkriptáz (BRL). A reakciót 50 pl 50 mmólos EDTA hozzáadásával állítjuk le, majd az elegyet PCI- vel extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A primer-extenziós terméket centrifiigálással gyűgyjük össze, szárítjuk és 20 pl színezett formamid oldatban, mely 90% ioncserélt formamidból, 10% 10* TBE-ből, 0,1% xiléncianol FF-ből (C.I. 42135) és 0,1% brómfenolkékből áll, feoldjuk. Minden mintából 10 pl-t viszünk fel egy 5%-os poliakrilamid - 8 mólos karbamid gélre. Az elektroforézist 2 óra hosszat 15 watt mellett végezzük. Szárítás után a gélt Kodak X- Ornat RP röntgen filmre exponáljuk Kodak X-Omatic C-2 kazettában. E vizsgálat eredményét az 1. ábrán mutatjuk be. Minthogy mind az EÍ-ON19, mind az EÍ-ON20 primer komplementer a HLZ mRNS-sel, a reverz transzkriptáz reakció után várható, hogy a HLZ-mRNS templáton elhelyezkedő, ezen primerekkel meghatározott extenziós termékek keletkeznek [C.D. Lee és D. C. Juse, Focus, 4,1-3 (1982)]. Mivel a HLZ-mRNS hoszsza nem volt ismert, a szintetizálódott DNS hosszát sem lehetett előre megjósolni. Mindazonáltal a következőket állapíthattuk meg: az EÍ-ON19 primer azzal a HLZ-mRNS szakasszal párosodik, amely a 63-68. aminosavakat kódolja, tehát a szintetizálódott DNS hossza legalább 203 bp + X kell legyen (X azon nukleotidok számát jelenti, amelyek a vezérszekvenciához és a nem kódoló 5’ szakaszhoz tartoznak). Ugyanilyen számítás szerint az EÍ-ON20 prímeméi 92 bp + X érték adódik. így tehát két olyan sáv volt várható, melyek nagysága 111 bp-ban különbözik. Az 1. ábra alapján látható, hogy az EÍ-ON19 primerrel kapott legerősebb sáv körülbelül 290 bp hosszú és az EÍ-ON20 primerrel kapott legerősebb sáv körülbelül 175 bp hoszszú szekvenciát jelent A két sáv közti különbség (115 bp) igen közel esik a számított értékhez és ebből azt lehet következtetni, hogy az U-937 sejtvonalból származó, vizsgált mRNS preparátum HLZ-mRNS-t tartalmaz. 4. példa U-937 cDNS génbank létehozása a) A cDNS szintetizálása A cDNS első szálának a szintézisét 50 pl reakciótérfogatban, az alábbi összetételben végezzük el: 50 mM trisz.HCl (pH-8,3), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM nátrium-pirofoszfát, 1,25 mM dGTP, 1,25 mM dATP, 1,25 mM dTTP, 0,5 mM dCTP, 20 pCi a-32P- dCTP (3.000 Ci/mmól; Amersham, PB.10205), 100 pg/ml oligo (dT)i8 (New England Biolabs), 40-100 pg/ml U-937 sejtvonalból izolált poliA+RNS és 250 egység reverz transzkriptáz (BRL). A reagáltatás 60 percen át, 42 ”C-on történik. A reakciót 50 pl 50 mmólos EDTA hozzáadásával állítjuk le és a reakció-termékeket PCI-vel extraháljuk. Az RNS/DNS hibridet etanol/2 mólos ammónium-acetát elegyével -20 “C-on egy éjszakán át csapjuk ki. A szintetizált első szál me-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
