202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 tartalmazó élesztő sejteket különböző táptalajokban tenyészthetjük, majd a kívánt HLZ terméket innen izoláljuk és ismert módszerek segítségével tisztítjuk. A HLZ expresszió-egység szerkesztésénél - alternatív megoldásként - egy élesztő szignál szekvenciát is beépíthetünk. Ebben az esetben azok az élesztő sejtek, amelyeket ilyen plazmiddal transzformálunk, képesek arra, hogy sejtfalukon keresztül a tenyészlébe válasszák ki a HLZ-t, ahonnan a kívánt tennék - a HLZ - kinyerhető, majd tisztítható. A kifejeződéshez különösen előnyösek az élesztő sejtek, mint gazdaszervezetek mivel az élesztő sejtek könnyen tenyészthetők, a fermentálás feltételei a nagy volumenű termeléshez adottak és az élesztők nem tartalmaznak endotoxinokat. Ennélfogva a jelen találmányban előnybe helyezzük az eukrióta mikroorganizmusok - ilyenek az élesztő tenyészetek - használatát. Az eukarióta mikroorganizmusok közül a leggyakrabban a Saccharomyces cerevisiae-t alkalmazzák, jóllehet általában számos más faj is hozzáférhető. Saccharomycesben való expresszióhoz rendszerint például az YRp7 plazmidot [Stinchcomb és munkatársai, Nature, 282, 39 (1979); Kingsman és munkatársai, Gene, 7 141 (1979); Tschumper és munkatársai, Gene, 8, 157 (1980)] és az YEpl3 plazmidot [Broach és munkatársai, Gene, 8,121-133 (1979)] használják. Az YRp7 a TRP1 gén tartalmazza, amely egy olyan élesztő mutánsnál, amely triptofán-mentes táptalajban képtelen növekedni, szelekciós markerül szolgál; ilyen például az ATCC 44076 letéti számú törzs. A TRP1 deléció, mint az élesztő-gazda genomjának jellemzője, hatásos segítséget jelent a transzformáció kimutatására, amikor a gazdasejtet triptofán nélkük tenyésztjük. Hasonló a helyzet az YEpl3 plazmidnál, amely a LEU 2 élesztő gént tartalmazza, s amelyet egy LEU-2 mutáns kiegészítésére lehet alkalmazni. Az élesztő vektorokhoz alkalmas promoter szekvenciák közé tartozik az ADHI 5’ határoló szakasza [G. Ammerer, Methods of Enzymology, 101, 192-201 (1983)], a 3-foszfoglicerát kináz [Hitzeman és munkatársai, J. Bioi. Chem., 255, 2073 (1980)] vagy más glükolitikus enzimek [Kawasaki és Fraenkel, BBRC, 108, 1107-1112 (1982)], mint az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát- dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfo-ffukto- kináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, foszfo-glükóz-izomeráz és glükokináz. A megfelelő expressziós plazmidok szerkesztésénél az ezekkel a génekkel asszociált terminátor szekvenciákat az expressziós vektorban a kifejezendő szekvencia 3’ végéhez szintén hozzá lehet fűzni, hogy a mRNS poliadenilációját és terminációját biztosítsuk. Vannak más promoterek, amelyeknek még az az előnyük, hogy transzkripciójukat növekedési feltételek szabályozzák, ilyen promoter szakaszokat tartalmaz az alkohol-dehidrogenáz-2, az izocitokróm-C, a savanyú foszfatáz, továbbá azok a lebontó enzimek, amelyek a nitrogén anyagcserével függnek össze, a fent említett gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz és azok az enzimek, amelyek a maltóz és galaktóz lebontásáért felelősek. Azokat a promotereket, amelyeket az élesztő mating-type lokusza szabályoz, például a BARi, MEC1, STE2, STR3, STE5 gének promotereit - hőmérséklettel szabályozott rendszereknél - a hőmérséklet-függő sir mutációk révén lehet alkalmazni [Rhine: doktori tézisek, Oregoni Egyetem, Eugene, Oregon (1979); Herskowitz és Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces I. rész, 181-209 oldal, Cold Spring Harbor Laboratory (1981)]. Ezek a mutációk befolyásolják az élesztő nyugvó mating-type kazettáit, s ezáltal közvetve a mating-type függő promotereket. Általában azonban minden olyan plazmid vektor alkalmas, amely élesztő-kompatibilis promotert és eredeti replikációs és terminátor szekvenciákat tartalmaz. Ha intakt HLZ-cDNS szekvenciával rendelkezünk, lehetővé válik más mikroorganizmusokban, például élesztőben való kifejezés céljára HLZ gént szerkeszteni. A HLZ-nek élesztőben való, találmány szerinti kifejeződéshez például olyan szekréciós plazmidokat alkalmazhatunk, amelyek vagy az ADHI-promoter-afaktor vezérszekvencia - HLZ gén - ADHII-terminátor szekvencia elemekből vagy az a-faktor-promoter - a- faktor-vezérszekvencia - HLZ gén - a-faktorterminátor szekvencia elemekből tevődnek össze. Az ADHI-promoter, az ADHII-terminátor és az a-faktorgén szekvenciái ismertek [L. Jeffrey és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 3018-3025 (1982); D.W) Russell és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 2674t2682 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 4049-4063 (1983)]. Egy ilyen módon szerkesztett HLZ gént egy kiválasztott élesztő promoterrel működőképesen lehet összekötni. Ezenldvül egy ilyen expresszió-egységet különböző élesztő vektorokba is integrálhatunk. E vektorok képesek az élesztőt transzformálni, s ez a humán lizozim szintéziséhez vezet el. A HLZ kifejeződéséhez, amely az ADHI promoter előnyös szabályozása alatt áll, egy olyan plazmidot szerkeszthetünk, amely az ADHI promoter 3’ vége mögött a teljes a- faktor vezérszekvenciát tartalmazza. Az a-faktor vezérszekvencia 3’ végéhez kapcsoljuk az érett HLZ-t kódoló DNS szekvenciát (HLZ gént) az a-faktor vezérszekvenciához képest megfelelő irányítottsággal. Egy olyan szerkezetet helyezünk előnybe, amely a képződő HLZ-nél pontos N- terminális létrejöttét biztosítja. Az expressziős kazetta végleges szerkezetébe az ÁDHH terminátor szekvenciát - amely a HLZ gén egységes terminációját eredményezi - úgy építjük be, hogy az közvetlenül a HLZ gén stop-kodonjához csatlakozva helyezkedjék el. Egy ilyen expressziós plazmidba minden említett elem a megfelelő sorrendben és egymáshoz képest a megfelelő irányítottsággal van jelen, továbbá pontos átmeneteket tartalmaz az ADHI promoter, a-faktor vezérszekvencia, HLZ gén és ADHII terminátor szekvenciák között. Különösen előnyös, ha az a-faktor vezérszekvencia és a rákövetkező HLZ gén közti kapcsolat úgy van kialakítva, hogy a LYS ARG után az a-faktor éréséért felelős proteáz hasítási hely pontosan az érett HLZ el-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
