202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 só aminosavát meghatározó szekvencia elótt helyezkedjék el úgy, hogy a gazdasejt által előállított HLZ protein egzakt N-terminális véget nyerjen. Az ilyen fajta expressziós kazettát különböző élesztő kifejező plazmidokba kapcsolhatjuk be. Előnyösek a multi-coli plazmidok, mint az YEpl3 [J.R. Broach és munkatársai, Gene, 8, 121-133 (1979)], a pJDB207 (letétbe helyezve 1984. december 28-án DSM 3181 letéti szám alatt), az YIp5 [K. Struhl és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1035-1039 (1979)] és a pEAS102. A pEASl02 plazmidhoz úgy juthatunk, hogy az YIp5 plazmidot Pstl-vel részlegesen és Bam- HI-vel teljesen megemésztjük és az izolált 4,3 kb (kilo bázis-pár) fragmentumot (az URA3 gént tartalmazza) a pJDB207-ből nyert 4,4 kb BamHI/PstI fragmentumhoz kapcsoljuk. Ezzel és az ilyen expressziós kazettát hordozó élesztő vektorokkal mindkét mating-type élesztő sejtet transzformálhatjuk az ismert eljárások szerint. A transzformált sejtek által termelt és a tenyészlébe kiválasztott HLZ-t ezután ismert protein tisztítási módszerekkel könnyen izolálhatjuk. Ugyancsak előnyösen mehet végbe a HLZ gén expressziója az a-faktor promoter szabályozása alatt is. Ekkor az érett HLZ-t meghatározó DNS szekvenciát megfelelő irányítottsággal kapcsoljuk be az a-faktor promoter és az a-faktor vezérszekvencia mögé. Az expressziós kazetta végleges szerkesztésénél az a-faktor vezérszekvenciát, HLZ gént és a-faktor terminátor szekvenciát egymás mögé soroljuk. Ebben az esetben is ugyanazt az átmenetet képezzük ki az a-faktor vezérszekvencia 3’ vége és a HLZ gén 5’ vége között, mint amilyet az ADHI promoter szabályozásával előállított expressziós kazettánál leírtuk. Ezt az expressziós kazettát beépíthetjük a már leírt élesztő kifejező-plazmidba, amellyel ezután ismert módszerek szerint transzformálhatunk élesztő sejteket. Ebben az esetben az a-mating-type élesztő törzsek az előnyös gazdák. E transzformált sejteknek a tenyésztése és az általuk kiválasztott HLZ izolálása ismert módszerekkel történik. Ezeknek a szerkezeteknek a révén számos előnyhöz jutunk: 1. A mRNS-nek egységes lesz a terminációja és így a mRNS stabilitása nő. 2. A HLZ izolálása a tenyészlé felülúszójából egyszerű lesz. 3. Nagy részaránya lesz a megfelelő tercier szerkezetű HLZ-nek, mivel a kiválasztott proteinben könnyebben képződhetnek diszulfid hidak, mint az élesztő sejtben. 4. A szekretáláskor az érett HLZ-től a szignál- vagy vezérpeptid endoproteolitikus úton egzakt módon válik le. Ezáltal pontosan meghatározott N-teiminális véggel kapjuk meg a proteint. Az érett HLZ protein N-terminális végén lizin van. A plazmid szerkezetét tehát úgy választjuk meg, hogy a szekréciós plazmidnál a lizin kodonja elé helyezzük a proteáz hasítási helyet. így a kiválasztott HLZ első aminosava a lizin lesz. A sejten belüli termelésnél az érett lizozim első aminosava elé egy start-ATG-t (metionin) kell helyezni, hogy a transzláció egyáltalán megindulhasson. Ez a metionin, amennyiben sejtes mechanizmus nem hasítja le, igen zavaró lehet (aktivitás, stabilitás, antigenitás). A mikroorganizmusokon kívül többsejtű szervezetek tenyésztett setjei szintén megfelelő gazdasejtek lehetnek. A HLZ kifejeződése szempontjából. Elvileg minden ilyen tenyészet alkalmazásra kerülhet, legyen az akár gerinces, akár gerinctelen állat sejt- tenyészete. A legnagyobb érdeklődésre mégis a gerinces állatok sejtjei tartanak számot, s így a gerinces állati sejtek tenyészetben való szaporítása (szövet-tenyésztés) az utóbbi években rutin módszerré vált [Tissue Culture, szerkesztők: Kruse és Patterson, kiadó: Academic Press (1973)]. Példák az alkalmas gazda-sejtvonalakra: VERŐ- és HeLa-sejtek, CHO-sejtek, W138, BHK, COS-7 és MDCK sejtvonalak. Az ezen sejteknél számbajövő kifejező vektorok rendszerint (ha szükséges) replikációs kezdőpontot, a kifejezendő gén elé helyezett promotert, a szükséges riboszóma kötőhelyekkel együtt, RNS illeszkedési helyet, poliadenilációs helyet és transzkripció-terminátor szekvenciát tartalmaznak. Emlős sejtekben való alkalmazás esetén az expressziós vektorok szabályozó funkcióit gyakran vírus eredetű anyagok látják el. A szokásosan alkalmazott promoterek például polyomából, adenovirus 2-ből és különösen gyakran a Simian vírus 40-ből (SV40) származnak. Az SV40 korai és késői promoterei különösen hasznosak, mivel a vírusból mindkettőt olyan fragmentum alakjában kaphatjuk meg, amelyek az SV40 virális replikációs kezdő pontját is tartalmazzák [Fiers és munkatársai, Nature, 273, 113 (1978)]. Az SV40-nek ezenkívül kisebb és nagyobb fragmentumait is felhasználhatjuk, feltéve, ha ezek azt a mintegy 250 bp hosszú szekvenciát tartalmazzák, amely Hindin hasítási helytől a BglI hasítási helyig - a vírus replikációs helyéig - terjed. Ugyancsak lehetséges és gyakran ajánlatos olyan promotereknek és szabályozó szekvenciáknak az alkalmazása, amelyek rendszerint a kívánt génszekvenciákhoz kapcsolódnak, feltéve, ha ezek a szabályozó szekvenciák a gazdasejt-rendszeirel kompatibilisek. Replikációs helyről vagy a megfelelő vektor szerkesztése révén gondoskodunk, amikor is kívülről származó helyet építünk be, például az SV40-ből vagy más virális forrásból (például polyoma, adeno, VSV, PBV, stb.) vagy pedig a gazdaszervezet kromoszómális replikációs mechanizmusa révén. Ha a vektort a gazdasejt kromoszómájába integráljuk, akkor az utóbb említett eljárás alkalmazása legtöbbször elegendő. A sejtek klónozó vektorokkal történő transzformációját számos eljárással elérhetjük, például kalcium segítségével, amikor vagy úgy járunk el, hogy a sejteket magnézium jelenlétében mossuk és a DNS-t a sejtek kalciumos szuszpenziójához adjuk hozzá vagy a sejteket a DNS és kálium-foszfát koprecipitátumával hozzuk össze. A gén ezután bekövetkező expressziójánál a sejteket olyan táptalajokra visszük át, amelyek a transzformált sejteket szelektálják. A találmány szerinti polipeptiden nemcsak az érett humán lizozimet (HLZ) értjük, amelyet részletesen tárgyalunk, hanem 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
