202923. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán lizozim előállítására
1 HU 202 923 B 2 komplementer farkakkal ellátott vekton-al keverjük össze, s ezek alkalmas fetételek mellett összekapcsolódnak. A rekombináció megtörténte után ezzel a keverékkel CaCh-dal kezelt E. coli sejteket traszformálunk, amelyeket ezután szelektív táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztünk. A HLZ-cDNS- t tartalmazó kiónokat különböző ismert módszerekkel azonosíthatjuk. A jelen találmányban a radioizotóppal jelzett, szintetikus oligonukleotidok segítségével végzett szűrést tartjuk előnyösnek. A HLZ proteinre leközölt aminosav szekvencia alapján két oligonukleotid készletet - mindkettőt 17 bázis hosszúsággal - szintetizálunk. Abból a tényből kiindulva, hogy különböző kodonok egy és ugyanazt az aminosavat határozhatják meg, mindegyik készlet különböző oligonukleotidokból álló keveréket tartalmazott. A minden lehető kombinációval járó szintézis biztosítja, hogy a meglévő oligonukleotidok egyike optimálisan párosul a HLZ génnel. A két egymástól független 17mer oligonukleotid pool alkalmazása csökkenti annak lehetőségét, hogy „fals pozitív” szekvenciákat válasszunk ki. A szűrővizsgálatokban a cDNS inszertumot tartalmazó baktérium kiónoknak a DNS-ét - telep-hibridizációs módszer alkalmazásával - nitrocellulóz szűrőkre visszük át. A nitrocellulóz szűrőket ezután - megfelelő feltételek mellett - a humán lizozim- specifikus 17-merek radiológiailag jelzett pooljaival hibridizáljuk. A megfelelő kiónok azonosítása után, minden klón DNS-ét izoláljuk és az inszertumokat Maxam és Gilbert módszerével (kémiai eljárás) vagy Sanger módszerével (szintézis dezoxinukleotidokkal) szekvenáljuk. A pozitív kiónok cDNS inszertumainak DNS szekvenciáit meghatározván lehetővé válik, hogy a potenciális protein aminosav szekvenciáját levezessük. Ennek a szekvenciának és a leközölt HLZ-aminosavszekvenciának az összehasonlítása alapján meg lehet állapítani, hogy a klónozott cDNS valóban tartalmazza-e a HLZ proteint kódoló szakaszt. Általában azok a vektorok használhatók fel a gazdasejtekben, amelyek a gazdasejtekkel kompatibilis fajokból származnak. A vektor a replikációs kezdőponton kívül rendszerint olyan felismerő szekvenciákat hordoz, amelyek lehetővé teszik a transzfomált sejtek fenotípus szerinti szelektálását. Például az E. colit rendszerint pBR322-vel transzformálják, azaz egy olyan plazmiddal, amely a E. coli fajból származik [Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95 (1977)]. A pBR322 ampicillin- és tetraciklin-rezisztencia gént tartalmaz, melyek egyszerű eszközül szolgálnak a transzformáit sejtek azonosításánál. A pBR322 plazmidnak és más plazmidoknak is ezenkívül saját promotereket kell tartalmazniuk vagy olyanképpen kell promotereiket módosítani, hogy a mikroorganizmus ezeket a saját proteinjeinek az expressziójához felhasználhassa. A rekombináns DNS-ek előállításánál leggyakrabban használt promoterek közé sorolható a béta-laktamáz (penicillináz) és a laktóz-promoter rendszer [Chang és munkatársai, Nature, 275, 615 (1978); Itakura és munkatársai, Science, 198, 1056 (1977); Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544 (1979)] és a triptofán (trp) promoter rendszer [Goeddel és munkatársai, Nucleic Acids, Res., 8,4057 (1980); 0036 776 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés]. Bár az említett promotereket használják a leggyakrabban, azonban ezeken kívül más mikrobiális promoterek alkalmazását is kifejlesztették. A HLZ-t meghatározó génszekvencia például a lambda bakteriofág bal (leftward) promoterének (Pl) a szabályozása alá helyezhető. Ez a promoter egy különösen erősnek ismert, szabályozható promoter. A szabályozást a lambda represszor teszi lehetővé. A vele szomszédos restrikciós hasítási helyek ismertek. Ezen génnek egy mutánsát - amely egy hőérzékeny represszort kódol - be lehet vinni egy olyan vektorba, amely a teljes HLZ szekvenciát tartalmazza. Ha a hőmérsékletet 42 °C-ra emeljük, a represszor inaktiválódik és a promoter maximális koncentrációban fejeződik ki. Az ilyen feltételek mellett képződő össz-mRNS elégséges kell legyen ahhoz, hogy egy olyan sejtet kapjunk, amelyben az új szintetikus ribonukleinsavaknak mintegy 10%-a a Pl promotertől származik. Ilyen módon lehetségessé válik egy olyan klónbanknak a létrehozása, amelyben egy funkcionális HLZ-szekvencia egy riboszóma kötőhely szomszédságában helyezkedik el, különböző távolságokra a lambda-PL-promotertől. Ezeket a kiónokat azután megvizsgálhatjuk és a legnagyobb kitermelést adó kiónokat szelektálhatjuk. A HLZ-szekvencia kifejeződése és transzlációja más olyan szabályozó rendszerek ellenőrzése alatt is végbemehet, amelyeket a szervezet nem transzformált alakjához is „homológ”nak számíthatunk. Egy laktózfiiggő E. coli például laktóz- vagy lac- operont tartalmaz, amely a ß-galaktozidäz enzim beindítása révén lehetővé teszi a laktóz lebontását. A lac szabályozó elemeket az E. colit fertőzni képes lambda-plac5 bakteriofágból kaphatjuk meg. A fág lac-operonja ugyanezen baktérium fajból származhat transzdukció révén. Azok a szabályozó rendszerek, amelyek a találmány szerinti eljárásban nyernek alkalmazást, olyan plazmid DNS-ből származhatnak, amely a szervezetre jellemző. A lac-promoter-operátor rendszert IPTG-vel (izopropil-ß-D-tiogalaktropiranozid) indukálhatjuk. Más promoter-operátor rendszerek vagy ezeknek részei éppilyen jól felhasználhatók: például az arabinóz-operátor, kolicin Ei- operátor, galaktóz-operátor, alkalikus foszfatáz operátor, trp- operátor, xilóz-A-operátor, tac-promoter és így tovább. Ilyen módon előnyösen lehet élesztő promotert is a HLZ-t kódoló szakaszhoz kapcsolni abból a célból, hogy biztosítsuk a HLZ hatékony kifejeződését. Az élesztő promotert speciálisan közvetlenül az érett HLZ-t kódoló szakasz elé kell helyezni egy transzlációs start szignállal (ATG), amit a kacsolódási helyre építünk be. Ezenfelül a HLZ expresszió-egységet különböző élesztő vektorokba is beépíthetjük, hogy ezután - az élesztő transzformálásának ismert eljárásai szerint - élesztőbe telepíthessük. A hibrid-plazmidokat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
