202922. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új limfotoxin-polipeptidek előállítására

1

HU 202 922 B

2

LT-mutáns-koncentrációkat, amelyek (az abszorpció csökkenésével mérve) a sejteknek a kezeletlen sejtkontrollhoz képest 50%-os lizisét eredményezik.

Egy egységként (U) olyan limfotoxin vagy LT-mutáns mennyiséget definiálunk, amely az adott sejtszám 5 50%-os lizisét indukálja.

Ebből az L929 indikárotsejtomalra a következő (a 8,2* 106 U/mg protein aktivitású jelenlévő TNF-standarddal szemben korrigált biológiai aktivitások adódnak: 10

Anyag Aktivitás (U/mg protein)

wfnÍAv ín n Ti C. 1.1 cO

Limfotoxin (LT)

6,1* 107

delta 23LT

1,2» 108

delta 24LT

2,(M08

15

delta 25LT

8.5-107

A WEHI-164 tumorsejtvonallal szemben a limfotoxinra, illetve a LT-mutánsokra

a következő biológiai

aktivitások adódnak (azokat a

proteinkoncentrációkat

20

adjuk meg, amelyek adott sejtszám 50%-os lizisét

okozzák):

Anyag

Proteinkoncentráció

EC50

(ng protein/ml)

25

LT

0,55

delta 23LT

0,29

delta 24LT

0,15

delta 25LT

0,38

30

12.Humán rekombináns limfotoxin és mutánsainak

szinergikus citotoxikus aktivitása humán rekombináns gamma-interferonnal tumorsejtekre.

Limfotoxin vagy a LT-mutánsok gamma-interferonnal együtt mutatott szinergikus aktivitásának kimutatására az emberi MG-63 csontszarkómát használjuk, amely egyedül limfotoxinra nem érzékeny, gamma-interferon azonban dózistól függően gátolja növekedését.

A vizsgálatot a következőképpen végezzük:

2*102 3 exponenciális növekedési szakaszban lévő sejtet szélesztünk mélyedésenként egy 96-lyukas lemezen komplett táptalajban (RPMI 1640 + 10% borjú magzatszérum, mindkettő a Flow Laboratories, Meckenheim-től), és éjszakán keresztül inkubáljuk 37 °C- on 5% szén-dioxidot tartalmazó, vízgőzzel telített atmoszférában. Utána állandó (rekombináns, humán) gamma- interferon koncentrációnál a limfotoxint vagy a limfotoxin- mutánst sorozatban 5-szörösen hígítjuk; a startkoncentráció 10 ng protein/ml. A végtérfogat mindenegyes tenyészetlyukban 150 pl Kontrollként tiszta táptalajt vagy gamma- interferon és/vagy LT, illetve LT-mutánsok nélküli sejttenyészeteket használunk. A tenyészlemezeket további 72 óra hosszat inkubáljuk az előbb megadott körülmények között, és utána a 11, példában leírtak szerint kristály ibolyával festjük, és fotometriásan kiértékeljük.

A gamma-interferon és limfotoxin MG-63 tumorsejtek elleni szinergikus hatásának meghatározásánál kapott kísérleti adatokat a 7. ábrában tüntetjük fel.

A limfotoxinok gamma-interferonnal együtt mutatott szinergikus hatását a következőképp határozzuk meg:

a) gamma-interferon sejtosztódásgátló aktivitását a minták optikai sűrűségéből a következő képlettel számítjuk ki:

gamma-INF aktivitás = 100%OD 540 nm (kezelt sejt) OD 540 nm (kontroll sejt)

•100%(A)

Példa: 2 ng/ml gamma-IFN; lásd 7. ábra.

gamma-IFN aktivitás = 100%- •100%-35% ^

1,85

b) gamma-interferon limfotoxinnal való kombinációja citotoxikus aktivitásának számítása az A képlet szerint.

Példa: 2 ng/ml gamma-interferon és 2 ng/ml LT; lásd 7. ábra.

0 83

gamma-interferon+LT aktivitás - 100%- tttt •100%-55%.

1,85

c) limfotoxinok gamma-interferonnal együtt gyakorolt szinergikus hatásainak meghatározása:

szinergikus hatásgmUidEä ± 50

gamma-IFN aktivitás

Példa: 2 ng/ml gamma-IFN és 2 ng/ml limfotoxin; lásd 7. ábrát és 12.a) és b) példákat.

. , . 55 % . „ 55

szinergikus hatás- -1,57.

2 ng/ml gamma-interferon 2 ng/ml limfotoxinnal

való kombinációja a 2 ng/ml gamma-interferon által egyedül kiváltott citotoxikus hatást 1,57-es faktorral 60

erősíti. Másik mérésnél 1,41 értéket kaptunk. A két sejtnél kapott átlagértéket tartalmazza az alább következő táblázat.

A gamma-interferon és a delta 24-limfotoxin-mutáns MG-63 tumorsejtvonallal szembeni szinergikus hatása meghatározásának kísérleti adatait a 8. ábrán ábrázoljuk. A delta 24-LT gamma- interferonnal kifejtett szinergikus hatását az előbb bemutatottak szerint határozzuk meg.

A gamma-interferon által kiváltott citotoxicitás limfotoxinnal vagy az itt leírt limfotoxin-mutánsok valamelyikével való kombináció útján fellépő erősítésének (szinergikus hatás) eredményeit a következő táblázatban foglaljuk össze.

6