202922. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új limfotoxin-polipeptidek előállítására
1 HU 202 922 B 2 LT-fajta gamma-IFN (ng/ml) 10 2 0,4 0,08 0,016 LT 2,0 1,61 1,49 1,40 1,27 1,15 0,4 2,16 1,89 1,75 1,87 1,42 delta 23 2,0 1,48 1,38 1,32 1,16 1,05 0,4 2,0 1,90 1,62 1,27. 1,24 delta 24 2,0 2,45 2,04 1,69 1,49 1,55 0,4 6,59 3,75 2,69 1,96 2,37 delta 25 2,0 2,61 1,89 1,63 1,38 1,41 0,4 8,30 3,45 3,04 1,45 1,65 A táblázatban megadott értékeket az előbb a 12.a)-12. c) példáknál közöltek szerint határoztuk meg, számítottuk ki, és az átlagértékek két független kísérlet eredményei tükrözik. 13. A toxicitás meghatározása. A vizsgálandó anyagok akut toxicitásának meghatározásához 4-6 hetes korú hím Balb/c egereket használunk. Az állatokat véletlenszerűen 5 állatból álló csoportokba osztjuk, és egy hetes akklimatizálódási idő elteltével a vizsgálati anyag különböző dózisait (0,25 mg/testsúlykilogramm-4,0 mg/testsúlykilogramm) adjuk be nekik intravénás injekcióként az egyik oldalsó farokvénába. A beadási térfogat 10 ml/testsúlykilogramm; az injektálás időtartama 10 másodperc. Az anyagokat közvetlenül az intravénás injektálás előtt oldjuk olyan fiziológiás sóoldatban, amely 0,2% BSA- t tartalmazó fiziológiás sóoldatot kapnak intravénásán. A vizsgálati anyagok injekciós beadása után az összes állatot 7 napi időtartamig megfigyelés alatt tartjuk. A következő tüneteket jegyezzük fel: hasmenés, mérsékelt helyváltoztatás, szőrmerevedés, cianózis és elhullás; ezenkívül rendszeresen mérjük az állatok testhőmérsékletét és testtömegét. Több vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy mind a limfotoxin (LT) mind a mutánsok (delta 23LT, delta XLeu Lys Pro Alá Alá His Asn Ser Leu Leu Trp Arg Alá Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Tyr Ser Pro Lys Alá Thr Ser Val Gin Leu Phe Ser Ser Gin Ser Ser Gin Lys Met Val Tyr His Ser met Tyr His Gly Alá Gin Leu Ser Thr His Thr Asp Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly általános képletű polipeptidek - amelyek képletében X jelentése treonil- (Thr-), szeril-treonil- (Ser-Thr-), metionil-treonil- (Met-Thr-), metionil-szeril-treonil- (Met-Ser- Thr-) csoport - vagy ettől legfeljebb 5%-ban eltérő aminosavszekvenciájú, limfotoxin- vagy limfotoxinszerű-hatású po-24LT és delta 25LT) a testhőmérséklet, a testsúly és a helyváltoztató mozgások dózis- és időfüggő csökkenését okozzák, valamint szőrmerevedést és hasmenést váltanak ki. Ezek a tünetek már az injekciós beadás után 2 órával kimutathatók, mindenekelőtt magasabb dózisok esetén, és a túlélő állatok esetében a 7-napos megfigyelési időn belül teljesen reverzibilisek. A megfigyelt tünetek azokban az állatokban a legkifejezettebbek, amelyeket LT-vel kezelünk. Azok az állatok, amelyeket az LT-mutánsokkal kezelünk, az LT-hez viszonyítva összességében gyengébben kifejeződő tünetegyüttest mutatnak, viszont a delta 23LT lényegesen erősebb tüneteket okoz, mint a delta 24LT; a delta 25LT közbülső helyzetet foglal el a delta 23LT és a delta 24LT között. Az egyes LDso-értékek becsült értékeit a következőképp számítjuk LD50 LT-re: 0,79 mg/testsúlykilogramm, LD50 delta 23LT-re: 1,84 mg/testsúlykilogramm, LD50 delta 25LT-re: 3,1 mg/testsúlykilogramm, LD50 delta 24LT-re: nem számolható, mivel bármilyen adagolásnál sem volt az állatok elhullása >50%. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a Be Gly Asp Pro Ser Lys Gin Thr Asp Arg Alá Phe Leu Gin Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Val Val Phe Ser Gly Lys Alá Pro Leu Tyr Leu Alá His Glu Pro Phe His Val Pro Leu Leu Gly Leu Gin Glu Pro Trp Leu Phe Gin Leu Thr Gin Gly Asp Be Pro His Leu Val Leu Ser Phe Alá Leu lipeptidek célzott mutagenezissel való előállítására, azzal jellemezve, hogy i) egy limfotoxint termelő sejtvonalból elkülönítjük az mRNS-t, ii) ezt az mRNS-t a megfelelő kétszálas cDNS-sé átmásoljuk, iii) ezt a cDNS-t E. coli vektorokba inszertáljuk, 15 20 25 30 35 40 Leu Asn Asn Gin Ser Tyr Pro Alá Gly Alá 55 60 7
